【商检行业标准(SN)】 进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法 兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2154—2008
进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法
兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术Determination of coagulase-positive staphylococciinimportandexportfood
Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium2008-09-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-03-16实施
SN/T2154—2008
本标准中直接平板计数法参照了ISO6888-2《食品和动物饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的检测方法第2部分：免血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术》[Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (staphylococcusaureusandspecies)Part2：Techniqueusingrabbitplasmafibrinogenagarmedium,MPN法参照了ISO6888-3《食品和动物饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的检测方法第3部分：MPN检测技术》[Microbiology of food and animal feeding stuffsHorizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci(staphylococcus aureus and species)Part3:Detection and MPNtechnique for lownumbersl。
本标准的附录A和附录B均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山西出入境检验检疫局。本标准主要起草人：赵贵明、刘沛、李卫华。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。I
1范围
进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法
兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术本标准规定了进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌的检测方法SN/T2154—2008
本标准中直接平板计数法适用于食品中凝固酶阳性葡萄球菌的计数，MPN法适用于凝固酶阳性葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品。动物饲料等其他食品可参照执行。2设备和材料
2.1灭菌设备：高压蒸汽灭菌锅和干热灭菌箱。2.2水浴箱：48℃±1℃。
2.3培养箱：36℃±1℃。
2.4吸管：1mL和10mL,分刻度分别为0.01mL和0.1mL。2.5接种环：3mm直径。
天平：量程2kg，灵敏度0.1g。
灭菌样品处理器具：取样勺，剪刀，开罐器等。样品稀释瓶：250mL、500mL。
无菌培养皿：直径90mm。
2.10均质器。
无菌试管。
酒精灯或煤气灯。
pH计。
金黄色葡萄球菌（凝固酶阳性）标准质控菌株：ATCC27217或其他来源的经验证合格的菌株。2.14
培养基和试剂
3.1兔血浆纤维蛋白原（RPF)琼脂培养基（见附录A第A.1章）。3.2改良GC肉汤（modifiedGiolittiandCantonibroth，见附录A第A.2章）。3.3水琼脂（见附录A第A.3章）。3.4蛋白陈氯化钠溶液（见附录A第A.4章）。第一法直接平板计数法
4检验程序
检验程序见图1。
SN/T2154—2008
5操作步骤
5.1样品的制备
25 qlml.样品一225 mL蛋H陈氧化钠落液，均质10倍察列稀释
选择3个连续的适宜浓度的样品勾液各取！ml.分别加入菌培养而内
每中加入15ml. --20 r
R琼暗培养茅，混
36 ℃1℃
24 h --.48 h
计教各平板苗游数
图1凝固酶阳性葡萄球菌直接平板计数法检验程序5.1.1样品的整个制备过程均应遵循无菌操作程序。5.1.2冷冻样品检验前可在0℃～4℃条件下解冻.时间不超过18h，也可在温度不超过45℃的条件解冻，时间不超过15min。
5.1.3液体样品应先将其充分摇匀。5.2样品匀液的制备
5.2.1固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，于盛有225mL蛋白陈氯化钠溶液的无菌均质杯内，于8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1：10样品匀液；或于装有225mL蛋白陈氯化钠溶液的无菌均质袋中.用拍击式均质器拍打1min～2min制成1：10的样品匀液。5.2.2液体样品：以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL蛋白陈氯化钠溶液的无菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1：10的样品匀液。5.2.3用10mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液10mL，沿管壁缓慢注于装有90mL稀释液的无菌三角瓶中，振摇均匀或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液如需进一步稀释，按上述顺序操作。5.3接种及培养
5.3.1根据对样品污染情况的估计，选择3个连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在做10倍递增稀释的同时，吸取1mL样品匀液于无菌平血内，每个稀释度做两个平血。5.3.2样品勾液移人平血后应及时将凉至48℃左右的RPF琼脂培养基（可放置于48℃土1℃恒温水浴箱中保温）注人平血约15mL～20mL，并转动平血使混合均匀。同时将RPF琼脂培养基倾入加2
有1mL空百稀释液的无菌平血内作对照。5.3.3待琼脂凝固后，翻转平板，置36℃士1℃培养箱，培养24h～48h。5.4典型菌落计数
SN/T2154—2008
5.41凝固酶阳性葡萄球菌在RPF琼脂培养基平板上形成黑色、灰色或白色的小菌落，外围有沉淀晕环注：菌落色泽与葡萄球菌还原亚碲酸钾的能力相关，大部分金黄色葡萄球菌形成黑色或灰色菌落，其他不还原亚碲酸钾的葡萄球菌则为白色菌落。凝固酶阳性的葡萄球菌产生的凝固酶将纤维蛋白原分解为不溶性纤维蛋白，使菌落外围出现沉淀晕环。
5.4.2选择菌落数在15～300之间的平板，挑典型菌落计数（见5.4.1描述），按平均典型菌落数乘以稀释倍数计算。
5.4.3若有两个连续稀释度在适宜计数范围内时，按式（1)计算：N=
式中：
N—样品中菌落数；
(n+0.1nz)d
平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和：n——适宜范围菌落数的第一稀释度(低)平板个数；适宜范围菌落数的第二稀释度（高）平板个数；n2
d稀释因子(适宜范围菌落数的第一稀释度）。示例：
稀释度
菌落数
1：100（第一稀释度）
(n, +0. ln,)a
1：1000（第二稀释度）
=(66+54+4+7)/[(1X2+0.1X2)X10-2=5955
上述数据经“四舍五入”后，表示为6000或6.0×103。.1）
5.4.4若所有稀释度的平板菌落数均小手15，则应按最低稀释度的平均典型菌落数乘以稀释倍数计算。
5.4.5若所有稀释度（包括液体样品原液）的平板均无典型菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
6凝固酶阳性葡萄球菌菌落总数的报告6.1菌落数在100以内时·按四舍五人”方式修约，采用两位有效数字报告。6.2天于或等于100时前第3位数字采用“四舍五人”方式修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五人”方式修约，采用两位有效数字。6.3若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效6.4固体或半固体样品以CFU/g为单位报告结果，液体样品以CFU/mL为单位报告结果第二法MPN法
7检验程序
检验程序见图2。
SN/T2154—2008
8操作步骤
8.1接种及培养
25ml)样品122元ml,蛋白陈熟化钠溶液,均质10倍系列稀释
选择3个适的稀释度，分别吸取1证群品划激丁改既GC肉汤，每个稀释度各接种3普36 ±1 :
24 h--.48 h
接种RPF琉脂铅养基平板
24 h---18 h
查MIN表
报告结果
图2凝固酶阳性葡萄球菌MPN法检验程序8.1.1分别在做10倍递增稀释的同时，选择适宜的3个连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以吸取该稀释度的吸管或微量移液器吸取1mL样品匀液，接种到9mL改良GC肉汤管，每个稀释度接种3管，如需做双料，则应吸取10mL样品匀液，接种到10mL改良GC肉汤管。每个试管中均加入适量冷却至48C左右的无菌水琼脂或石蜡，凝固后使形成密封状态。要求样品的最高稀释度，能达到获得阴性终点。将上述接种物36℃土1℃培养24h土2h。8.1.2如试管中的液体变色或出现黑色沉淀，用3mm接种环移取1环分别划线接种RPF琼脂培养基平板.36℃士1℃培养，24h～48h：如试管中的液体没有产生黑色沉淀或变色，则继续培养24h士2h，培养至48h后，无论试管有无变黑，均需用接种环分别划线接种RPF琼脂培养基平板，36℃士1℃培养，24h～48h后观察结果。注：接种环移取肉汤培养物前，先无菌去除水琼脂或石蜡层。8.2典型菌落确认
凝固酶阳性葡萄球菌在RPF平板上皇黑色或灰色，基至白色的小菌，外围有沉淀晕环。8.3结果计算
计算有典型菌落的RPF琼脂培养基平板所对应的管数，查MPN检索表（见附录B）。9报告
根据检索表的数值，报告样品中凝固酶阳性葡萄球菌的含量，单位：MPN/g或MPN/mL。4
A.1兔血浆纤维蛋白原(RPF)琼脂培养基A.1.1成分
A.1.1.1基础成分
胰酪陈
酵母粉
牛肉粉
丙酮酸钠
L-甘氨酸
氯化锂
蒸馏水
A.1.1.2亚碲酸钾溶液
（规范性附录）
培养基和试剂
SN/T2154—2008
称取1g亚碲酸钾，加入100mL蒸馏水或去离子水中，通过0.22um孔径的滤膜进行过滤除菌，并于3℃士2℃保存不超过1个月，若溶液中出现白色沉淀应弃去A.1.1.3牛纤维蛋白原溶液
称取5g牛纤维蛋白原，加人100mL蒸馏水或去离子水中，临用时配制。A.1.1.4免血浆和胰酶抑制剂溶液称取30mg胰酶抑制剂，加人30mL含EDTA的兔血浆，临用时配制。A.1.2制法
将培养基的各个基础成分加蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH7.2士0.2.121℃高压灭菌15min冷却至48℃左右备用（48℃水浴）。无菌加人预热至48℃左右的1%亚碲酸钾溶液2.5mL、牛纤维蛋白原溶液75mL及免血浆和酶抑制剂溶液25mL，混勾后铺平板备用。该平板应立即使用，避免血浆沉淀的出现。
A.2改良GC肉汤（modifiedGiolittiandCantonibroth）A.2.1成分
A.2.1.1基础成分
胰酪陈
牛肉粉
酵母粉
氯化锂
甘露醇
氯化钠
甘氨酸
丙酮酸钠
Tween-80
蒸馏水
1000mL
SN/T2154—2008
A.2.1.2亚碲酸钾溶液
称取1g亚碲酸钾溶于100mL蒸馏水或去离子水中，通过0.22um孔径的滤膜进行过滤除菌，并于3℃土2℃保存不超过1个月，若溶液中出现白色沉淀应弃去A.2.2制法
将培养基的各个基础成分加入蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH6.9士0.2，适量分装，121℃高压灭菌15min，冷却至48℃左右备用。无菌加入0.1mL1%亚碲酸钾溶液于每9mL单料管，0.2mL于每10mL双料管，混匀后使用A.3水琼脂
称取13.0g细菌学琼脂粉于1000mL蒸馏水或去离子中，加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至48℃左右备用。
蛋白陈氯化钠溶液
A.4.1成分bzxz.net
蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
A.4.2制法
1000mL
将各成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节pH，121℃高压灭菌15min，灭菌后pH7.0士0.1（25℃）。6
SN/T21542008
附录B
（规范性附录）
1g(mL）检样中最近似值（MPN）表表B.1
阳性管数
阳性管数
注1：本表采用3个稀释度[0.1g（mL).0.01g（mL)和0.001g（mL)]，每个稀释度接种3管注2：表内所列检样量如改用1g(mL）、0.1g(mL）和0.01g（mL）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL）、0.001g(mL）、0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推SN/T 2154-2008
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法
兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术SN/T21542008
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张0.75字数14千字反2008年11月第一次印刷
2008年11月第一版
印数1—2000
书号：155066：2-19277
定价8.00元
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。