【商检行业标准(SN)】 动物源性食品中大环内酯类抗生素残留检测方法 第3部分：微生物抑制法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1777.3—2008
动物源食品中大环内酯类抗生素残留检测方法第3部分：微生物抑制法Determination of macrolide residues in animal-origin food-Part3:Microbialinhibitionmethod2008-09-16发布
2009-03-16实施
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局SN/T1777.3—2008
本部分主要起草人：王敏、顾鸣、郭德华、杨捷琳、韩丽、邓晓军、杨惠琴、陈墨莲。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准I
1范围
动物源食品中大环内酯类抗生素残留检测方法第3部分：微生物抑制法SN/T1777.3—2008
SN/T1777的本部分规定了动物源食品中大环内酯类兽药残留检测的试样制备、保存和微生物抑制检测方法。
本部分适用于肉类、水产品、动物内脏、鸡蛋和牛奶中大环内酯类兽药筛选检测.阳性结果应用其他方法进行确证。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过SN/T1777的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682一2008ISO3696：1987，MOD）3试样制备和保存
3.1试样制备
3.1.1牛奶：取不少于500mL试样，装人清洁容器内，进行标记3.1.2肉类、水产品、动物内脏：从原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放人高速组织捣碎机均质，充分混匀，用四分法缩分不少于500g试样。装人清洁容器内，进行标记。3.1.3蛋：从原始样品中，随机分出一半（不少于500g），鲜蛋需去壳，进行标记注：制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。3.2试样保存
3.2.1牛奶：0℃~4℃保存。
3.2.2肉类、水产品、动物内脏和蛋：试样于一18℃以下保存。4测定方法
4.1方法提要
试样经压榨得到样液.样液加到含有一定数量的嗜热脂肪芽孢杆菌培养基中，64℃培养3h～4h。利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试样中是否含有抗生素。4.2设备和材料
4.2.1恒温箱：64℃±1℃。
4.2.2离心机。
高速组织捣碎机。
均质器。
恒温水浴锅：80℃。
涡旋振荡器。
肉类榨汁器
SN/T1777.3—2008
4.2.8克氏瓶。
4.2.9安。
4.2.10可调移液器10μL100μL，100μL1000μL，4.3菌种和培养基
4.3.1菌种
4.3.1.1嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilusvar.calidolactisATCC1o149。4.3.2培养基
4.3.2.1细菌保存及传代培养基：见附录A第A.1章。4.3.2.2增菌固体培养基：见附录A第A.2章。4.3.2.3检定培养基：见附录A第A.3章。4.4试剂
本标准所用化学试剂为分析纯，试验用水为蒸馏水、去离子水，试验用水应符合GB/T6682的规定。
4.4.1指示剂：溴甲酚紫.制法见附录A.3.2。4.4.2甲醇。
4.4.3标准溶液：
4.4.3.1标准物质泰乐菌素：纯度≥98%。4.4.3.2泰乐菌素标准储备液：100ug/mL。称取标准物质泰乐菌素10.0mg（精确至0.1mg）.用甲醇溶解并定容至100mL，得到终浓度为100μg/mL的泰乐菌素标准储备液，置2℃～8℃冰箱中保存，可使用1个月。
4.4.3.3泰乐菌素标准工作液：0.05μg/mL。吸取一定量的泰乐菌素标准储备液，用甲醇稀释成0.05ug/mL的泰乐菌素标准工作液，置2℃～8℃冰箱中保存，可使用1周。4.5测定步骤
4.5.1样液制备
4.5.1.1肉类、水产品、动物内脏：用肉类榨汁器榨汁，取大约250L汁液作为待测样液。4.5.1.2蛋：取禽蛋液体至清洁容器中，均质后直接取样。4.5.1.3牛奶：直接取样。
4.5.2菌悬液的制备
般情况下，菌种的传代次数不应超过5代，否则在每次使用前确证其生化特性没有发生变异，或另需购置新的标准菌株。在确定保存的菌种生化特性没有改变后，将复活的菌种分别接种于盛有增菌固体培养基的克氏瓶中，55℃士1℃培养72h镜检芽孢数达80%以上（如果达不到，可再培养数日，芽孢数量仍达不到要求，菌种可能变异，不可使用），用灭菌生理盐水洗下菌苔，使其悬浮于生理盐水中，80℃水浴加热30min，2000g离心20min，弃上清液.用灭菌生理盐水重复洗涤芽孢两次。然后用灭菌生理盐水制成菌悬液，用稀释平板计数的方法或比浊法进行菌体计数以确定菌悬液的浓度，菌悬液中菌体细胞的含量应达到1.0×10°CFU/mL。置2℃～8℃冰箱保存，贮存期1个月。4.5.3检定安的制备
将嗜热脂肪芽孢杆菌菌悬液加入到融化后冷却至60℃左右的灭菌检定培养基中，充分混匀，使培养基中嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到1.0×10°CFU/mL。在灭菌安靓中加入1mL混合液，保持水平待其凝固。取制备好的检定安靓，加人100uL0.05ug/mL泰乐菌素标准工作液，室温放置20min后，64℃士1℃培养3h～4h，琼脂培养基颜色不变色，仍呈现紫色的安颜为合格，达不到要求的安应弃去。制备好的安颜置2℃～8℃冰箱可保存1周。4.5.4测定
取制备好的检定安韶，其中一个加人100uL0.05μg/mL泰乐菌素标准工作液作为阳性对照，一2
SN/T1777.3—2008
个加人100uL阴性样品样液作为阴性对照。吸取100uL待测样液加人检定安中，将安放置室温，20min预扩散；对于蛋、鱼、肾脏样品，预扩散后，需置于80℃水浴加热10min。预扩散后，用蒸馏水洗涤安两次，洗去待测样液，去除安内剩余的水，用铝箔纸封住安口。将安置于培养箱中，64℃士1℃培养3h～4h，直到阴性对照安颜色变为黄色时停止培养。取出安颜，根据安内固体琼脂底部的三分之二部分的颜色判定结果4.6检测结果判断和报告
如果待测样液安颜内琼脂底部三分之二部分由紫色变为黄色，阳性对照安部内琼脂底部三分之二部分仍呈现紫色，即报告“阴性”。如果待测样液安和阳性对照安颜内琼脂底部三分之二部分仍呈现紫色，即报告“初筛阳性”。
初筛阳性的样品可进一步用β-内酰胺酶排除β-内酰胺类药物，P-氨基苯酸排除磺胺类药物的可能（参见附录B第B.2章）。
阳性样品需要用确证方法进行定性和定量分析。5检测限
检测限见表1。
表1检测限
大环内酯类兽药
泰乐菌素
红霉素
柱晶白霉素
交沙霉素
螺旋霉素
替米考星
检测限/（μg/kg）
SN/T 1777.3—2008
A.1细菌保存培养基
A.1.1成分
胰蛋白陈
植物蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
pH7.3±0.2
A.1.2制法
1000mL
（规范性附录）
培养基
将各成分加热溶解，分装试管，121℃高压灭菌15min，制成斜面。注：制成半固体时，琼脂量为0.5%。A.2增菌固体培养基
A.2.1成分
胰蛋白陈
植物蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钾
蒸馏水
pH7.3±0.2
A.2.2制法
1000mL
将各成分加热溶解，分装300mL于克氏瓶内，121℃高压灭菌15min。A.3检定培养基
A.3.1成分
牛肉膏
大豆蛋白陈
蛋白陈bzxz.net
蒸馏水
氯化钠
磷酸氢二钾
吐温-80
溴甲酚紫
葡萄糖
pH7.8±0.2
1000ml
0.6%溴甲酚紫溶液配制：称取0.6g溴甲酚紫溶于100mL蒸馏水中。SN/T1777.3—2008
将各成分加热溶解，分装每瓶100mL，每瓶中加人0.6%溴甲酚紫溶液1mL.121℃高压灭菌15 min。
SN/T1777.3—2008
附录B
（资料性附录）
菌种的理化性状测定和β-内酰胺类、磺胺类药物的排除B.1菌种的理化性状测定
定期对菌种进行理化性状测试，以确定菌种没有受到污染或变异。对性状改变的菌种，需购置新的ATCC菌种。测试的基本方法如下：将菌种ATCC10149接种到传代培养基上.64C培养18h后菌落为黄色，鉴定结果见表B.1。
菌种ATCC10149生化反应
革兰氏染色镜检
酪素水解
淀粉水解
精氨酸-氨甲酰天冬氨酸脱水酶水解吲哚水解
明胶水解
注“十”表示阳性；“一”表示阴性。B.2β-内酰胺类和磺胺类药物的排除卡巴肼水解
树胶醛酶
甘油水解
肝糖水解
甘露醇水解
水杨苷水解
D-海藻糖水解
卵磷脂
75%~84%+
75%~84%+
16%~25%+
对于初筛阳性的样品，加入20μLβ-内酰胺酶溶液（110活性单位/mL）到230μL样液中，混匀后，吸取100uL到检定安中培养。如果测定结果为阴性，则样品中可能含有β-内酰胺类药物。对于初筛阳性的样品，加人50μLp-氨基苯酸溶液（5mg/mL）到200μL样液中，混勾后，吸取100uL到检定安颜中培养。如果测定结果为阴性，则样品中可能含有磺胺类药物。6
Foreword
AnnexAof thispartisanormativeannexAnnexBofthispartisaninformativeannexSN/T1777.3—2008
This part was proposed by and is underthechargedof certificationand accreditation administation ofthePeople's Republic of ChinaThis part was drafted by Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People's Republic of China
Main Drafter of this part are Wang Min,Gu Ming,Guo Dehua,Yang Jielin,Han Li,Deng Xiaojun.Yang Huiqin, Chen Molian.
This part is a professional standard for entry-exit inspection and quarantine promulgated for the firsttime.
SN/T1777.3—2008
Determinationofmacrolideresiduesinanimal-originfoodPart3:Microbial inhibitionmethodScope
SN/T 1777 this part specifies the method of sample preparation and determination of macrolide resi-duesbymicrobial inhibitionmethod inanimaloriginfoodThis part is applicable to the screening inspection of macrolide residues in meat,fishery product,an-imal harslet,milkand egg.Anypositiveresultshouldbeconfirmed byothermethod.2Normativereference
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text,consti-tute provisions of this part.For dated reference, subsequent amendments to (excluding editing cor-rections),or revisions of,any of these publications do not apply.However.parties to agreementsbased on this part are encouraged to investigate the possibility of applying the most resent editionsof thepart indicated below.For undated references,the latest edition of thenormative document re-ferredtoapplies.
GB/T6682Water for analytical laboratory useSpecifications and testmethods(GB/T 66822008.ISO3696:1987.MOD）
Samplepreparationandstorage
3.1 Samplepreparation
Milk:Take at least 5o0 mL milk sample.place into a clean container and mark it.Meat,fishery product and animal harslet:Take a representative portion from the original3.1.2
sample.place the edible part in a high-speed tissue blender.homogenize the sample thoroughly.Takeat least5oo g homogenized sample with quarterdividingmethod.Placethe sample into a clean con-tainer and mark it.
3.1.3Egg:Randomly take half sample (at least 500 g) from the original. Remove the shell. Blendeggyolkand whitethoroughly ina blenderandplacethemixtureinaclean container.Mark thecon-tainer.
SN/T1777.3—2008
Note:When preparing sample,measures should be taken to avoid contamination or anyfactor that may cause the changesof prepared testing samples.3.2Storageof prepared sample3.2.1
Milk:Stored at 0℃~4℃.
Meat,fishery product.animal harslet and egg:The prepared testing sample should be storedat -18 ℃.
Methodofdetermination
General introduction
Thepreparedtestingsampleiscrushed,and thesample liquid is obtained.Thesample liquid isaddedtoagar medium whichcontain Bacillus stearothermophilus var.calidolactis,then incubateat 64 ℃1℃ for3h~4h.Utilize the inhibiting effectof antibiotics on sensitivebacteria to determine if thereareantibioticsinthetestsample.4.2
Equipmentsandmaterials
Incubatorsetat64℃±1℃
Centrifuge.
High-speed tissueblender.
Homogenizer.
Water bath:80℃.
Vortex mixer.
Meat juice crusher.
Kolleflask.
Pepette:10μL~100μL.100μL~1000μL9
SN/T1777.3—2008
4.3Bacteriaand media
Bacteria
Bacillusstearothermophilusvar.calidolactisATcC101494.3.2
Media forpreservationand transportationof bacteria:Refer toAnnexA.1.Solidmediaforreproductionofbacteria:RefertoAnnexA.2Mediaforbioassay:RefertoAnnexA.34.4Reagents
All chemical reagents should beanalyticpure.The water used inthismethod shouldbedistilled waterordeionizedwater,andshouldbeinconformitywithGB/T66824.4.1
Indicator:bromocresolpurple.refertoAnnexA.3.2.Methanol.
Standard solution
Tylosinstandards：Purity≥98%Stockstandardsolutionoftylosin(100μg/mL):Tomake100μg/mLstockstandardsolu-tion,weigh 10.0 mg(±0.1 mg)tylosin.dissolve tylosin in a certain amount of methanol.bring the fi-nal concentrationto1o0μg/mL.Thestock standardsolutionshouldbestored inrefrigeratorat2℃~8℃andcanbeusedforonemonth
Standard working solutions(0.05 μg/mL):Dilutethe stock standard solution of tylosin(1oo μg/mL)to workingconcentration with methanol.The working standard solution should bestored at 2 ~8 ℃ and can be used for one week.Procedure
Sampleliquidpreparation
Meat,fisheryproductand animal harslet:Obtainabout250 μLmeat juicebycrushing the
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