【商检行业标准(SN)】 进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法 第3部分：免疫磁珠法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T0184.3—2008
进出口食品中单核细胞增生
李斯特氏菌检测方法
第3部分：免疫磁珠法
Determination of Listeria monocytogenes in food for import and export-Part3:Immuno-magneticbeadsassay2008-09-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局bzxz.net
2009-03-16实施
本部分的附录A、附录B均为规范性附录，本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局本部分主要起草人：吴斌、李振荣、胡传伟、王玉萍、蒋维旗本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准SN/T0184.3—2008
1范围
进出口食品中单核细胞增牛
李斯特氏菌检测方法
第3部分：免疫磁珠法
SN/T0184.3—2008
SN/T0184的本部分规定了进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌取样、制样和免疫磁珠检测方法。
本部分适用于进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过SN/T0184本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分·然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T0184.1进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法3方法概述
将直径0.05m～4m具有磁性的微珠的表面化学修饰，开与李斯特氏困特异性抗体结合，制成免疫磁珠，它能与食品中李斯特氏菌抗原结合，从而检出食品中的李斯特氏菌。样品经24h～48h增菌后·分别取1mL增菌液和20uL免疫磁珠加人带盖塑料管中，在磁板背景下混合，如果有李斯特氏菌抗原存在，免疫磁珠就会将其捕获，然后利用磁性将免疫磁珠聚集，经清洗后接种到显色培养基和任选一种培养基（OXA或PALCAM琼脂）,对于选择性分离平板上典型李斯特氏菌菌落进行确认，最终通过系列试验确定是否存在单核细胞增生李斯特氏菌4设备和器具
4.1培养箱：37℃±1℃；41.5℃±1℃。4.2水浴锅：45℃±1℃。
4.3微量移液器：20μL~200μL,10uL,1mL。4.4刻度移液管：5mL、10mL。
4.5灭菌玻璃器具：量筒、三角烧瓶、培养皿（直径90mm）、试管。4.6灭菌管（Eppendorf管）：1.5mL。4.7抗李斯特氏菌免疫磁珠：该磁珠可以通过商业途径获得。应准确地按照生产商的说明书进行操作。
4.8旋涡混合器。
4.9带有磁架的磁性分离器。
5培养基和试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。5.1胰酪大豆肉汤（TSB-YE）：见第A.1章。1
SN/T0184.3—2008
5.2胰酪大豆琼脂（TSA-YE)：见第A.2章。5.3Fraser肉汤增菌液（FB，FB,）：见第A,3章。5.4OXA琼脂：见第A.4章。
5.5PALCAM琼脂：见第A.5章。
5.6显色培养基。
注：本部分使用的培养基为CHROMagar公司产品，其他公司的等效显色培养基应验证后使用。5.7磷酸盐缓冲溶液（PBS)：见第A.6章。5.8参考菌株：单核细胞增生李斯特氏菌（CMCC54002）。6检验步骤
6.1样品制备
在均质袋中加入25g样品，再加入225mLFB，增菌肉汤（见5.3）30℃培养24h土1h。6.2增菌
取1mL6.1中制备好的样品，加到10mLFB增菌液（见5.3）中，35℃培养24h士1h后.进行免疫磁珠分离。
6.3免疫磁珠分离（IMS）
6.3.1免疫捕获
混合6.2增菌培养液，沉淀所有的粗糙食物残渣，从增菌培养液中移取1mL上层液体（要尽可能避免移取到食物颗粒和脂肪颗粒）加入Eppendorf管（见4.6）中，加20μL准备好的免疫磁珠（见4.7）。在旋涡混合器（见4.8）上混合该悬液。6.3.2分离
将Eppendorf管固定在磁架（见4.9）的管孔中，180°轻缓摆动磁架5次～6次，使免疫磁珠聚集到磁极。小心地打开磁架上的Eppendorf管管盖，从磁极对面一侧慢慢吸出液体，注意不要接触管壁上的磁珠，每一个样品换一次枪头加1mL灭菌的PBS（见5.7），并重新盖好盖子，将磁极从支架上移走，180°轻缓摆动磁架5次～6次，使管内各成分混合，然后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几次。将离心管从磁性分离器上移开，并加100μL灭菌的PBS（见5.7)到管中，重悬磁珠。如果实验室没有磁性分离器，也可以用手摇代替。6.4分离培养
6.4.1分离培养
吸取50μL免疫磁珠悬液，加到显色培养基（见5.6）及任一选择性培养基OXA（见5.4）、PALCAM（见5.5)琼脂平板上，用无菌接种环划线，35℃±1℃培养24h～48h。6.4.2筛选
李斯特氏菌在CHROMagar显色培养基上菌落为蓝色，且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在OXA琼脂平板上生长24h后菌落呈现黑色，直径为1mm，在其周围形成一个黑色环，培养48h，菌落仍呈黑色，直径2mm～3mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。季斯特氏菌在PALCAM琼脂平板上与在OXA琼脂平板上菌落相似。在CHROMagar显色培养基及OXA或PALCAM琼脂平板上挑取5个或更多可疑菌落，接种于TSA-YE琼脂（见5.2）平板上，纯培养后进鉴定。
6.5鉴定和确认
单核细胞增生李斯特氏菌的鉴定和确认按SN/T0184.1执行，单核细胞增生李斯特氏菌检验程序图见附录B。
7质量控制
每次检验均应用单核细胞增生李斯特氏菌（见5.8)进行质量控制。2
结果判定
SN/T0184.3—2008
8.1凡通过本方法在被检食品中分离获得的纯菌落.各项生化试验结果均符合SN/T0184.1所规定的生化特征，报告为在25g被检食品中检出单核细胞增生李斯特氏菌。8.2各项生化试验结果不符合SN/T0184.1所规定的生化特征，报告为在25g被检食品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。
安全防护
单核细胞增生李斯特氏菌为生物安全二级病原微生物。微生物检测实验室的工作人员对该菌进行检验时，应遵守GB19489中关于实验室生物安全防护的要求。易被其感染的年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者应远离单核细胞增生季斯特氏菌分离、鉴定和确认的试验场所。3
SN/T0184.3—2008
胰酪陈大豆肉汤（TSB-YE)
A.1.1成分
胰酪蛋白陈（或胰蛋白陈）
植物蛋白陈
氯化钠
磷酸二氢钾
葡萄糖
酵母浸膏
蒸馏水
A.1.2制法
（规范性附录）
培养基和试剂
1000mL
将上述各成分加热煮沸溶解冷却后，调pH至7.1~7.5，分装，121℃灭菌15min，备用。2胰陈大豆琼脂（TSA-YE)
A.2.1成分
胰酪蛋白陈（或胰蛋白陈）
植物蛋白陈
氯化钠
酵母浸膏
蒸馏水
2制法
1000mL
除琼脂外，将其他各成分加热煮沸溶解冷却后，调pH至7.1～7.5，再加人琼脂，121℃灭菌15min，备用。
A.3Fraser肉汤增菌液（FB,，FB2）A.3.1基础肉汤
A.3.1.1基础肉汤成分
酪蛋白酶消化物
动物组织酶消化物
牛肉浸膏药
酵母浸膏
氯化钠
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
七叶苷
氯化锂
蒸馏水
1000mL
A.3.1.2制法
SN/T0184.3—2008
将上述成分置于50℃水浴中充分溶解，冷却后调pH至7.0～7.4.分装，121℃灭菌15min。A.3.2盐酸吖啶黄溶液
盐酸吖啶黄
灭菌蒸馏水
振摇混匀，充分溶解后过滤除菌，避光保存。A.3.3萘啶酮酸钠盐溶液
萘啶酮酸
0.05mol/L氢氧化钠溶液
振摇混匀，充分溶解后过滤除菌A.3.40.05mol/L氢氧化钠溶液
氢氧化钠
灭菌蒸馏水
振摇混匀，充分溶解。
A.3.5柠檬酸铁铵溶液
柠檬酸铁铵
灭菌蒸馏水
振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。A.3.6Fraserm肉汤FB，增菌液
A.3.6.1Fraserm肉汤FB，增菌液成分盐酸吖啶黄溶液
萘啶酮酸钠盐溶液
柠檬酸铁铵溶液
A.3.6.2制法
将A.3.6.1中各成分按上述体积加入到1000mLA.3.1基础肉汤中，无菌分装于10mL，大试管中备用。
A.3.7Fraserm肉汤FB,增菌液
A.3.7.1Fraserm肉汤FB,增菌液成分盐酸吖啶黄溶液
萘啶酮酸钠盐溶液
A.3.7.2制法
将A.3.7.1中各成分按述体积加入到1000mLA.3.1基础肉汤中，无菌分装于10mL大试管中备用。
A.4OXA琼脂
A.4.1成分
蛋白陈
氯化钠
柠檬酸铁铵
七叶苷
氯化锂
SN/T0184.3—2008
蒸馏水
吖啶黄素
头孢双硫唑甲氧
放线菌酮
硫酸盐粘功菌素
磷霉素
A.4.2制法
1000mL
除吖啶黄素、头孢双硫唑甲氧、放线菌酮、磷霉素、硫酸盐粘菌素和琼脂外，将其他成分加热煮沸溶解冷却后，调pH至7.0～7.4，再加人琼脂，121℃灭菌15min，冷却至50℃，无菌操作，加入用5mL乙醇和5mL无菌水溶解的吖啶黄素、头孢双硫唑甲氧、放线菌酮、磷霉素，摇匀，倾注平板。5PALCAM琼脂
A.5.1成分
蛋白陈
酵母浸膏
氯化钠
D-葡萄糖
D-甘露醇
柠檬酸铁铵
七叶苷
氯化锂
蒸馏水
盐酸吖啶黄素
硫酸多粘菌素B
复达新
A.5.2制法
1000mL
除盐酸吖啶黄素、硫酸多粘菌素B、复达新和琼脂外，将其他各成分加热煮沸溶解冷却后，调pH至7.0～7.4，再加入琼脂，121℃灭菌15min，冷却至50℃，无菌操作，加人用适量无菌水溶解的盐酸吖啶黄素、硫酸菌素B、复达新，摇匀，倾注平板A.6磷酸盐缓冲溶液（PBS）
A.6.1成分
氯化钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钾
氧化钾
A.6.2制法
1000mL
将各成分溶解于蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠调至pH7.2。121℃高压灭菌15min，用蒸留水加至1000mL贮存冰箱。
附录B
（规范性附录）
单核细胞增生李斯特氏菌检验程序检25g（mL）
225 ml「B增幽液（见第A.3草）（3)，24 h［h）1mL转种1mLB增南液（第A.3丧）（35，21h±1b）通过免疫邀球捕获李斯特菌，然后再用火菌缓冲液洗涤用0.1ml.的火菌绥冲液中新制成忌液SN/T0184.3—2008
吸取bD uL 免疫磁乐总液划线于CItrMagar显色培养基、(OXA/IALCAM 脉脂平(35 芒+1 , 21 h ～ 48 h)
各挑选5个典型菌落
接种丁 TSA YI: 琼脂下板，纯培养鉴定和确认试验按 SN/T 0184. 1 执行图B.1
单核细胞增生季斯特氏菌检验程序图
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