【商检行业标准(SN)】 菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1586.2—2008
菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法
Identification of Pseudomonas savastanoi pyphaseolicola(Burkholder)Gardan etall2008-09-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-03-16实施
本部分的附录B和附录C为规范性附录，附录A为资料性附录本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局本部分主要起草人：刘鹏、崔铁军、廖芳、刘跃庭、冯洁、王金成本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T1586.2—2008
1范围
菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法
SN/T1586.2—2008
SN/T1586的本部分规定了进出境植物检疫中菜豆晕疫病菌（Pseudomonassauastanoipv.phaseolicola)的检疫鉴定方法
本部分适用于进出境菜豆（Phaseolusvulgaris）、大豆（Glycinemax）等的植物种子中菜豆晕疫病菌的检疫和鉴定，
2原理
2.1病菌分类地位和重要特征
菜豆晕疫病（Haloblightof beans）是菜豆、大豆等豆科植物上的严重病害，该病的病原菌为菜豆晕疫病菌（Pseudomonassauastanoipv.phaseolicola）。菜豆晕疫病菌属原核生物界（Procaryotes），薄壁菌门（Gracilicutes），假单胞菌科（Pseudomonaceae），假单胞菌属（Pseudomonas）；单胞，杆状，直或微弯，革兰氏阴性，极鞭单生或多生，能运动，无鞘，无孢子，一般大小（0.5um～1.0um）×（0.4um~～1.5um），代谢呼吸型，化能有机营养型，接触酶阳性，精氨酸双水解酶阴性，氧化酶阴性。相关资料参见附录A。
2.2鉴定原理
菜豆晕疫病菌的形态特征、生物学特性、生化特性、寄主范围、传播途径，以及分子生物学特征作为制定本检疫鉴定标准的依据。
3仪器、用具
——生物显微镜；
生物安全柜（或超净工作台）；高压灭菌器：
—小型电动粉碎机；
恒温培养箱；
一离心机；
—PCR仪；
—电泳设备；
一凝胶成像系统；
一其他常规实验室设备、器具及试剂。4主要试剂
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用水双蒸水。其他试剂比如各种溶液、缓冲液和培养基都是检测方法特有的，都应按附录要求准备。商品化试剂参见其使用说明。
双氧水（3%），蛋白陈，酵母粉，硫酸镁（MgSO，·7H,O），蔗糖（C12Hz2O），磷酸氢二钾（K，HPO,），琼脂多聚蛋白陈，甘油，乙二胺四乙酸（EDTA），三羟甲基氨基甲烷（Tris），盐酸，冰乙酸，磷酸二氢钾（KH,PO）.磷酸氢二钠（NaH,PO,），琼脂糖，溴化乙锭，TaqDNA聚合酶，10XPCR缓冲液，dNTP（2.5mmol/Leach），溴酚蓝，二甲苯青FF，2ooobpMarker。1
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细菌微量生化鉴定管：D-甘露醇戊二酸盐。生化鉴定试纸条：氧化酶试纸条。5检疫鉴定方法及步骤
5.1病原菌的分离
5.1.1植株分离方法
5.1.1.1种植观察
将待测的种子种植于温室或实验室的育苗钵中，每一育苗钵种植2粒种子，每份种子样品种植不少于3000粒，生长环境适宜温度为20℃～25℃，相对湿度大于或等于70%，种子出苗1周后开始观察。发生病害的典型症状为种植期间有发病的幼苗，叶片表现为褪色花叶型，有萎為的情况。若观察到有典型症状的发生，则采集可疑病株进行病原菌的分离培养。5.1.1.2病叶中病原菌的分离
用灭菌剪刀剪取病叶上的病斑，用含有效氯1%的次氯酸钠溶液表面消毒1min，无菌水清洗三次，然后将其移至灭菌培养血上，加5滴～6滴无菌水，用灭菌镊子将病斑夹碎，使病组织液溶于无菌水中。用接种环蘸取该液，在选择性培养基（MSP，见附录B）上划线，每一一处理做三个平血（规格直径为90mm，下同），28℃恒温培养48h。5.1.2种子分离方法
选取待测菜豆种子150g.用75%酒精浸泡1min，无菌水清洗三次，在无菌环境中晾干；将种子放人经灭菌处理的小型电动粉碎机中破碎（或将晾干的种子放人灭菌纸袋中，用锤子砸碎），之后装人一灭菌的大三角瓶中，加灭菌水200mL，4℃振荡过夜；取浸出液进行差速离心，1000r/min离心10min，弃沉淀，取上清液再进行8000r/min的离心10min，之后将沉淀用2mL无菌水稀释；取稀释液1ml再进行系列浓度的稀释，分别为1/10.1/100.1/1000，1/10000，1/100000：将每个浓度的稀释液在MSP培养基平皿上进行涂布，10uL/平血，每个浓度做三个平皿。培养皿在28℃恒温条件下培养48h。
5.2可疑菌株的分离纯化
根据附录B中菌落在MSP培养基上的菌落特征，挑取可疑的单个菌落，在523或金氏B培养基上连续转接2次～3次，可得到纯化后的分离菌。对可疑菌株进行下一步骤。5.3革兰氏染色
对可疑菌株进行革兰氏染色。用牙签挑取菌落放在载玻片上与3%氢氧化钾（KOH)液滴搅拌，然后慢慢拉出，有拉丝现象的为革兰氏阴性菌，无拉丝现象的一般为革兰氏阳性菌对可疑菌株进行革兰氏染色。可用革兰氏染色试剂进行简单染色观察菌体形状。若可疑菌株经鉴定为革兰氏阴性菌，且菌体形状为杆状，则进行下一步骤（见5.4）。否则排除可疑菌落。
5.4生化指标初筛检测
对可疑菌株进行以下四项生化指标的检测。对于能够符合生化指标（接触酶阳性，氧化酶阴性，D-甘露醇阴性，戊二酸盐阴性）的菌株，则进行下一步骤（见5.5）。否则排除可疑菌落。5.5分子生物学检测
采用特异性引物P1/P2对可疑菌株进行PCR检测，用菜豆晕疫病菌标准菌株作阳性对照，用非菜豆晕疫病菌的植物病原细菌作阴性对照·用水作空白对照进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。在阳性对照扩增片段大小为0.5kb的单带的前提下，可疑菌株扩增结果与阳性对照一致，可判断分子生物学检测结果为阳性。具体实验步骤和试剂配置见附录C。6结果判定
若分离的细菌菌株在选择性培养基上的菌落特征与描述相符、符合革兰氏染色阴性的结果和菌体2
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形状为杆状、符合5.4中各项生化指标的检测结果、分子生物学检测为阳性，可以判定检出菜豆晕疫病菌。
菌株保存
分离并最终鉴定为菜豆晕疫病菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃左右低温冰箱中保存，定期（30d～60d)转接，以防止病菌死亡；必要时冻干后长期保存。3
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附录A
（资料性附录）
菜豆晕疫病菌（Pseudomonassavastanoipv.phaseolicola）相关资料A.1英文名
Haloblightofbeans
A.2学名
Pseudomonassavastanoipv.phaseolicola。A.3分布
埃塞俄比亚，肯尼亚，马达加斯加，马拉维，毛里求斯，摩洛哥，罗德里格斯岛，卢旺达，南非，坦桑尼亚，乌干达，刚果，赞比亚，津巴布韦，印度，以色列，日本，巴基斯坦，沙特阿拉伯，土耳其，也门，澳天利亚，斐济，新西兰，奥地利，比利时，英国，保加利亚，捷克，斯洛伐克，丹麦，法国，德国，匈牙利，爱尔兰，意大利.荷兰，波兰，罗马尼亚，西班牙，瑞典，瑞士，前苏联，前南斯拉夫，加拿大，墨西哥，美国，巴巴多斯，哥斯达黎加，多米尼加共和国，瓜德罗普群岛，马提民克，圣文森特，阿根廷，智利，哥伦比亚，秘鲁，苏里南，委内瑞拉，中国（黑龙江）。A.4寄主范围
菜豆（Phaseolusuulgaris）、大豆（Glycinemaa）、豌豆（Pisumsatiuum）、绿豆（Vignaradiata）、木豆（Cajanuscajan）、多花菜豆（Phaseoluscoccineus）、月豆（Phaseoluslunatus），葛（Puerarialobata）、野葛（Puerariathunbergiana），慧豆（Vignaunguiculata）、桑橙（Macroptiliumatropurpureum）、Glycinejavanica,Glycine wightiiA.5传播方式
菜豆晕疫病菌主要通过带菌种子作远距离传播。在田间则通过风雨、灌溉传播。附录B
（规范性附录）
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菜豆晕疫病菌（Pseudomonassavastanoipv.phaseolicola）常用的培养基配方B.1金氏B培养基
蛋白陈20g.甘油10g.硫酸镁（MgSO.·7H,O)1.5g，磷酸氢二钾（K,HPO,)1.5g，琼脂15g.蒸馏水1000mL。调整pH值至7.2121℃湿热灭菌20min。B.2523培养基
蛋白陈8g，酵母粉4g.硫酸镁（MgSO·7H,O)0.3g，蔗糖（C12H22Ou）10g，磷酸氢二钾(K,HPO）2g，琼脂18g，水（HO)1000mL。调整pH值至7.0~7.1.121℃湿热灭菌20min。B.3MSP培养基
蛋白陈5g，硫酸镁（MgSO,·7H,O)0.025g，蔗糖（CizH22Om）20g，磷酸氢二钾（K，HPO4)0.5g，琼脂20g，水（HzO)1000mL。调整pH值至7.2~7.4,121℃湿热灭菌20min，之后冷却到45℃加人下列经过细菌滤膜过滤的试剂：放线菌酮（100mg/mL.用75%的甲醇溶解）头孢氨芋（10mg/mL，用水溶解）万古霉素（10mg/mL，用水溶解）溴百里酚蓝（15mg/mL，用95%的酒精溶液溶解）B.4选择性培养基上的菌落形态特征2mL
菜豆晕疫病菌在MSP培养基上形成圆形、边缘整齐的黄色菌落，48h菌落直径在1mm～1.5mm，典型的特征是生长期间有浅蓝色色素产生，366nm紫外光下观察有蓝色荧光，并扩散到培养基中。
B.5普通培养基上的菌落形态特征菜豆晕疫病菌在523培养基上形成圆形、黄绿色菌落，48h菌落直径在1mm～1.5mm（随转接代数增加，菌株的生长速度会加快），边缘整齐，典型的特征是生长期间有浅黄绿色素产生，并扩散到培养基中。
菜豆晕疫病菌在金氏B培养基上的菌落形态与523培养基类似，但菌落颜色较523稍浅5
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附录C
（规范性附录）
菜豆晕疫病菌（Pseudomonassavastanoipv.phaseolicola）的PCR检测方法C.1试剂制备
C.1.1TAE电泳缓冲液（50X储存液，pH约8.5）：242gTris碱，57.1mL冰乙酸.37.5gNaEDTA·2Hz0加H,O至1L,
用时蒸馏水稀释50倍。
C.1.2TE缓冲液：
1ommol/LTris·Cl.pH8.0.
1mmol/LEDTApH8.0
2PCR反应模板制备
可直接用培养的菌株稀释成菌悬液（>10°CFU/mL）作为PCR反应模板。3定性PCR检测
检测引物
P1:5*-AGCTTCTCCTCAAAACACCTGCP2:5'-TGTTCGCCAGAGGCAGTCATG
（扩增产物0.5kb）
C.3.2PCR反应体系（30μL）
10XPCR缓冲液
dNTP(2.5mmol/Leach)
引物P1(10mmol/L)
引物P2（10mmol/L)
Taq(5 U/μL)
模板DNA
C.3.3PCR反应程序免费标准bzxz.net
94℃/3min；94℃/30s；60℃/30s；72℃/40s；38循环；72℃/5min：4℃。C.3.4PCR扩增产物的检测
1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下进行分析并拍照，记录实验结果。1）可按《精编分子生物学实验指南》中的方法提取细菌基因组DNA，提取后可用TE缓冲液溶解，一20℃保存。6
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