【商检行业标准(SN)】 绵羊地方性流行病微量补体结合试验操作规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 20332007
绵羊地方性流产病微量补体结合试验操作规程
Protocol of micro-complement fixation test for enzootic abortion of ewes2007-12-24发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-07-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
绵羊地方性流产病微量补体结合试验操作规程
SN/T2033—2007
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spe.net.cn
电话：68523946
68517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张0.75字数15千字
2008年3月第一版2008年3月第一次印刷印数1—2000
书号：155066·2-18507
定价8.00元
YKAONT KAca
本标准的附录C、附录D为规范性附录，附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王玉玲、侯艳梅、姜红、赵祥平、董志珍、霍蕾。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T2033—2007
1范围
绵羊地方性流产病微量补体结合试验操作规程
本标准规定了绵羊地方性流产病微量补体结合试验的操作技术要求。本标准适用于绵羊地方性流产病的血清学诊断2规范性引用文件
YKAONT KAca
SN/T2033—2007
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696）3试剂和材料
3.1试剂
3.1.1.试验用蒸馏水为GB/T6682中的三级水3.1.2稀释液：生理盐水。
3.1.3补体结合抗原：按说明书使用，使用前充分摇勾。3.1.4阳性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。阴性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。3.1.5
3.1.6溶血素：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。3.1.7补体：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。3.1.8绵羊全血：选健康成年绵羊，无菌颈脉采血，1.2份阿氏液加1份血，混，4℃冰箱内稳定3d~5d后使用。
3.2材料
3.2.1玻璃试管：10mm×75mm，圆底.洁净。3.2.2试管架。
3.2.3微量移液器
3.2.4可调连续加样器
3.2.596孔\U”型微量板
3.2.696孔平底（）微量板。
3.2.7水平转子离心机
3.2.8ELISA读板仪
3.3被检血清
3.3.1采血和分离
按常规方法采血和分离血清。血清应新鲜，无蛋白絮凝物，无溶血，无腐败气味。3.3.2运送和保存血清
防止血清冻结，若3d内不能送到实验室.需用冷藏方法运送血清。血清应放至4℃冰箱内保存。1
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4操作方法
4.1预备试验
4.1.13%红细胞悬浮液的制备
绵羊全血充分混匀后，取所需量用稀释液洗三次，每次水平转子离心机2000r/min离心4.1.1.1
5min，最后一次离心10min。
取出1份沉积血泥加入到24份稀释液中，充分混匀，制成红细胞悬浮液4.1.1.3
取出250uL红细胞悬浮液加人到4.75mL蒸馏水中，使红细胞充分破解（液体清亮）。取出100uL破解后的液体加入到平底微量板孔内，平行加8个孔。4.1.1.4
用ELISA读板仪540nm下读OD值.算出平均OD值.代人校正红细胞浓度公式厂见式（1）4.1.1.5
式中：
校正红细胞浓度到3%所需加入的稀释液量；平均OD值；
红细胞悬浮液量
.........
4.1.1.6取校正红细胞浓度时所需的稀释液量加入到红细胞悬浮液中即得3%红细胞悬浮液4.1.2溶血素效价的测定
稀释溶血素
（1）
取0.2mL溶血素原液，加人到19.8mL稀释液中，制成1：100稀释的溶血素，再按表1稀释成不同稀释滴度的溶血素。
表 1溶血素的稀释
稀释滴度
1:1000
1:1500
1:2000
1:3000
1:10000
溶血素量/ml
(1:100溶血素)1.0
(1：100溶血素）2.0
(1：100溶血素)0.5
(1：100溶血素)0.5
(1:1000溶血素)1.0
(1:1000溶血素)1.0
(1:1000溶血素)1.0
注：如果溶血素是由等量甘油保存,则溶血素原液所需量加倍，并相应减少稀释液量。制备不同稀释滴度的溶血素致敏红细胞4.1.2.2
稀释液/ml
取7个试管，每管加1.5mL3%的红细胞悬浮液，然后分别缓慢加人不同稀释滴度的溶血素1.5mL，混匀，37℃水浴箱中感作15min，4.1.2.3溶血素效价的确定
将补体原液预稀释至1：150.按表2进行测定。表2
试管号
稀释液/mL
1/150补体/mL
溶血素效价测定
试管号
不同稀释滴度致敏红细胞/mL
溶血素稀释滴度
冷稀释液/mL
表2（续）
1/1000
1/1500
1/3000
-YYKAOTKAca
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1/5000
37℃水浴30min（每间隔5min振1次）2.0
1/10000
将各管用水平转子离心机500×g离心3min，取上清液100L分注平底微量板，540nm下读OL值。按公式（OD值X100/0.115)算出各管溶血度，在普通坐标纸上以溶血素的稀释度为横坐标，溶血度为纵坐标，绘制曲线，确定出现平高线的点，比此浓度高25%的稀释度定为溶血素的工作效价（即为1.25倍，溶血素工作效价=溶血素稀释滴度×80%)（参见附录A）。4.1.3制备致敏红细胞悬浮液
按测定的溶血素效价稀释溶血素.缓慢加入到等量的3%绵羊红细胞悬浮液中，混合均匀，置37℃水浴箱中感作15min。
4.1.4补体效价的测定
补体预稀释至1/150，做2组重复管，按表3进行测定。表3补体效价测定
试管号
1/150补体/mL
稀释液/mL
第一次感作
致敏红细胞
第二次感作
冷稀释液（mL）
37℃水浴30min
37℃水浴30min（每间隔5min振1次）2.0
将各管用水平转子离心机500×g离心3min，取上清液，540nm下读OD值，按公式（双管平均OD值X100/0.115)计算出各管的溶血度(Y)，在双对数坐标纸上以Y/(100一Y)为横坐标，补体用量为纵坐标，制成一直线，找出50%溶血时补体的用量（含1个CH50单位），代入公式：补体稀释倍数5×50%溶血时补体用量，即得出本试验补体工作效价（含2.5个CH50单位）（参见附录B）。4.1.5抗原效价的测定
4.1.5.1对照血清稀释灭活
阳性对照血清和阴性对照血清分别用稀释液作1：4稀释，置58℃水浴箱中灭活30min4.1.5.2阳性对照血清倍比稀释
见附录C。
4.1.5.3抗原从1：4作倍比稀释
见附录C。
4.1.5.4建立方阵试验
在“U”型微量反应板中进行。
试验程序：25uL血清+25uL抗原+25uL补体->37℃振荡感作40min-→+25uL致敏红细胞→37℃振荡感作30min，同时设立血清对照、抗原对照、补体对照（见附录C）。4.1.5.5记录测定结果
取出微量反应板，水平转子离心机500Xg离心3min，与标准比色孔（比色孔的配制见附录D）比3
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较，观察溶血度，记录结果，
4.1.5.6抗原效价的确定
在对照成立时，与阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价，即为1个单位抗原，本试验抗原使用2个单位。4.2正式试验
4.2.1溶血素、抗原、补体按预试验测定的工作效价稀释4.2.2被检血清和阳性对照血清、阴性对照血清做1：4稀释，置58℃水浴箱内灭活30min4.2.3将灭活后的阳性对照血清和阴性对照血清在“U”微量反应板中进行倍比稀释。一般阳性对照血清做八个稀释度，阴性对照血清可做三个稀释度。4.2.425μL血清+25μL抗原+25μL补体-37℃振荡感作40min→+25μL致敏红细胞→37℃振荡感作30min，同时建立阳性血清对照、阴性血清对照、抗原对照、补体对照和红细胞对照（见表4）。4.2.5取出微量反应板，水平转子离心机500×g离心3min，比照标准比色孔，记录结果。表4血清效价的测定
稀释度
血清试验孔
血清/uL
抗原/μL
稀释液/μL
补体/μL
第一次感作
致敏红细胞/ul
第二次感作
5判定
血清抗补
体对照
1/161/32
21/641/128
1/2561/512
252525
5.1被检血清效价的确定
37℃振荡40min
37℃振荡30min
补体对照
2.5个补
体单位
补体单位补体单位
比照标准比色孔判读，达到50%抑制溶血时血清的最高稀释度为该血清的效价。5.2结果判定
5.2.1各对照的结果成立时，可进行判定。否则，补体的效价应重新测定，并重新做4.2试验。阳性血清对照：阳性对照血清效价与已知效价或预测效价变化范围不超过一个滴度。阴性血清对照：100%溶血。
血清抗补体对照：抗补体对照孔100%溶血（如果抗补体对照孔与试验孔的抑制溶血程度相同说明该血清为抗补体）。
抗原对照：100%溶血。
补体对照：
-2.5个单位补体对照：100%溶血；—1.25个单位补体对照：部分溶血；0.625个单位补体对照：不溶血。红细胞对照：不溶血。
5.2.2阳性判定：一般被检血清稀释1：4以上（包括1：4达到50%抑制溶血时判为阳性。5.2.3阴性判定：一般被检血清稀释1：4小于50%抑制溶血时判为阴性。F0
附录A
（资料性附录）
溶血素效价的确定
1/10000 1/5000 1/3000 1/2000 1/1500 1/1000图A.1
溶血素效价的测定
17/500
YKAONT KAca-
SN/T2033—2007bzxz.net
SN/T2033—2007
附录B
（资料性附录）
补体效价的确定
0. 1 0.9 0.6 1.7u.80.81
补体效价的确定
抗原/ul
阳性对
照血清/
1/10阴性对照
血清/uL
补体工作效价/μL
稀释液/μl.
第一次感作
致敏红细胞/μL
第二次感作
附录C
（规范性附录）
抗原效价测定表
方阵试验
抗原稀释度
37℃振荡40min
37℃振荡30min
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注：抗原对照为100%溶血，补体对照为100%溶血，红细胞对照为不溶血，血清对照为100%溶血时，试验成立。SN/T 2033—2007
制备血红素
附录D
（规范性附录）
标准比色孔的配制
D.1.1取3%绵羊红细胞1.5mL.加入到10.5mL蒸馏水中充分破解。D.1.2加人4.25%氯化钠（NaCI)3.0mL,即可。D.2制备0.3%绵羊红细胞
取3%绵羊红细胞1.5mL，加入到13.5mL稀释液中。D.3
标准比色管的配制
按表D.1进行配制。
试验管
溶血度/%
血红素/ml
0.3%绵羊红细胞/mL
标准比色孔的配制
标准比色管的配制
取0%~100%溶血度溶液各100uL，分注相应的微量孔内。SN/T 2033-2007
书号：155066·2-18507
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