【商检行业标准(SN)】 猪繁殖和呼吸综合征检疫规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1247—2007
代替SN/T1247.1~1247.2—2003
猪繁殖和呼吸综合征检疫规范
Quarantine protocol for porcine reproductive and respiratory syndrome2007-08-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-03-01实施
SN/T1247—2007
本标准代替SN/T1247.1—2003《猪繁殖和呼吸综合征间接免疫荧光试验》和SN/T1247.2—2003《猪繁殖和呼吸综合征免疫过氯化物酶单层试验》。本标准的附录A、附录B、附录C和附录D是资料性附录本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙颖杰、张伯强、白泉阳、苏永生、简中友、袁文泽、赵祥平、董志珍。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1247.1—2003;
SN/T1247.22003。
1范围
猪繁殖和呼吸综合征检疫规范
本标准规定了猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)的检疫规范。SN/T1247—2007
本标准适用于猪繁殖和呼吸综合征的病毒分离鉴定、病毒抗原监测、病毒抗体检测，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18090—2000猪繁殖和呼吸综合症诊断方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
免疫过氧化物酶单层试验immunoperoxidasemonolayerassay（IPMA）培养的单层细胞，接种PRRS病毒或处理过的被检样品，让30%～50%细胞感染，经组织固定和内源酶处理，加被检血清或阳性抗体处理，再加酶标抗抗体，经过显色反应检测抗原或抗体的存在。在PRRS诊断上最早用于检测其抗体3.2
间接免疫荧光试验indirectfluorescentantibodytest（IFA）成切片或涂片的标本经过固定后，加抗血清处理，再加荧光标记的抗抗体染色，漂洗，滴加缓冲甘油后用盖玻片封载，用荧光显微镜进行检测。检测抗体，可用于早期诊断。4疾病概述
猪繁殖和呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS），也称为蓝耳病（Blue-earedDisease），是由猪繁殖和呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪及育成猪呼吸困难为特征的接触性传染病。繁殖障碍的特征是流产、死胎和产弱仔，弱仔由于呼吸道疫病和继发感染常常很快死亡；呼吸道特征是仔猪及育成猪呼吸困难，年龄较大的猪可能出现温和性呼吸道症状，有时因继发感染而使病情复杂。其病原、流行病学、诊断以及检疫与诊断参见附录A。5检疫方法
5.1病毒的分离与鉴定（见GB/T18090一2000）5.1.1设备、材料和试剂
5.1.1.1器材：96孔或48孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径0.2um的微孔滤膜、普通光学显微镜。5.1.1.2试剂：RPMI1640培养液、牛血清、青霉素（10*IU/mL）与链毒素（10μg/mL）溶液、7.5%碳酸氢钠溶液等。
SN/T1247—2007
5.1.1.3细胞：猪原代肺泡巨噬细胞培养物（PAM)或MARC-145或HS2H细胞。PAM由无PRRS猪获取，并经批次检验合格.制备和检验方法参见附录C。MARC-145或HS2H细胞由国家指定单位提供。
5.1.2样品的采取和送检免费标准下载网bzxz
在发病早期，无菌采取病猪的血清或腹水。对病死猪（如流产的死胎）和扑杀猪（如弱胎猪），应立即采取肺、扁桃体和脾等组织，置4℃保存，立即送实验室检疫。不能立即送检者，应置一30℃～一25℃冰箱中，或加50%甘油生理盐水，4℃保存送检。5.1.3样品的处理
血清和腹水可直接使用。肺、脾和扁桃体等组织经处理后可单独使用，也可混合使用。各组织剪碎后研磨成糊状，加入RPMI1640培养液，制成10%悬液，3000×g离心15min，吸取上清液，加人青霉素500IU/mL、链霉素500μg/mL、庆大霉素500μg/mL和两性霉素B200μg/mL。怀疑有细菌污染的样品，可用0.2um微孔滤膜过滤处理。5.1.4操作方法
5.1.4.1稀释样品
取细胞培养板每孔加人细胞培养液RPMI1640（含特牛血清10%、青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL、两性霉素B10μg/mL、pH7.2)90μL，在A1和C1孔内加人同一份已处理的样品各10μL（样品10倍稀释）。将板轻轻摇动后，从A1和C1排孔各取10μL分别移入B1和D1排孔内（样品100倍稀释）。除第6列和第12列留作正常细胞对照外，其他各孔的样品稀释方法同上。振动稀释板后加盖置4℃冰箱内保存备用。
5.1.4.2制备细胞板
已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离物特别是欧洲型病毒株的良好生长，因此病毒分离应首选PAM细胞，先将PAM细胞泥用细胞培养液RPMI1640稀释，使细胞终浓度为1X10°个/mL，或将MARC-145或HS2H细胞用营养液稀释，细胞终浓度5X10个/mL。然后，在另一换96孔细胞培养板上每孔加入上述细胞悬液100L，于37℃5%二氧化碳恒温培养至形成单层细胞。按照上述操作，每板可检测20份样品，每份样品重复两个滴度。第6列和第12列留作正常细胞对照（不接种样品）。
5.1.4.3接种样品
由样品稀释板每孔内各吸取稀释的样品液50uL，接种于已形成细胞单层的细胞板相应的孔内（第一代）。细胞板加盖后，放人37C5%二氧化碳保湿恒温箱中培养，每天观察致细胞病变作用（CPE），连续观察2d~5d。CPE通常在接种后1d～4.d内出现，主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落5.1.4.4培养物盲传
根据第一代培养物CPE出现的情况（通常在接种后的第2d～3d）安排盲传。盲传时，不论CPE有无，一律各取孔内混悬液25L，移人新细胞板相应的孔内。再于37C5%二氧化碳恒温箱培养2d~5d.每天观察CPE。
5.1.5结果的判断和解释
在第二代培养结束时，不论是否出现CPE，对所有的孔应采用免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）或间接免疫荧光试验（IFA)进行终判；其结果呈现阳性反应的，则被认定为PRRS病毒分离阳性。5.2免疫过氧化物酶单层试验（IPMA)（见GB/T18090）5.2.1材料准备
5.2.1.1器材：微量移液器、倒置显微镜等。5.2.1.2试剂：IPMA诊断板的制备参见附录C；标准阳性血清、标准阴性血清和免抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供，使用前按说明书规定稀释至工作浓度；洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶液参照附录B自行配制。
SN/T1247—2007
5.2.1.3样品：采集被检猪血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释。5.2.2操作方法
5.2.2.1取已作20倍稀释的被检血清加人IPMA诊断板同一排相邻的2个病毒感染细胞孔（V十）和其后的1个未感染细胞孔（V一）内，每孔50L，同时设立标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，以血清稀释液代替血清设立空白对照，封板并于4℃条件下过夜。5.2.2.2弃去板中液体，用洗涤液洗板3次，每孔100μL，每次1min3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。
5.2.2.3每孔加人工作浓度的兔抗猪过氧化物酶结合物50uL，封板后放在保温盒内于37C恒温箱中感作60min。
5.2.2.4弃去板中液体，洗涤3次.方法同5.2.2.2。5.2.2.5每孔加入显色/底物溶液50μL，封板于室温（18℃~24℃）下感作30min5.2.2.6弃去板中液体，洗涤1次，方法同5.2.2.2，再用三蒸水洗涤2次，最后在吸水纸上轻轻拍干，待检。
5.2.3结果判定与解释
将IPMA诊断板置于倒置显微镜判读。在对照标本都成立的前提下，即空白对照感染细胞孔(P：V+)和未感染细胞孔（P：V一)均应为阴性反应；标准阳性血清对照感染细胞孔（P·V十）应呈典型阳性反应，未感染细胞孔（P。V-）应为阴性反应；标准阴性血清对照感染细胞孔（N·V+）和未感染细胞孔（N·V一）均应呈阴性反应；被检血清未感染细胞孔（V一)不应出现阳性反应。被检血清标本的细胞浆（可能仅见于部分细胞）出现弥漫状或团块状棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性，记作IPMA（十）；无棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阴性，记作IPMA（一）。IPMA（十）者表明被检猪的血清中含有PRRS病毒的抗体。5.3间接免疫荧光试验（IFA)（见GB/T18090）5.3.1材料准备
5.3.1.1器材
荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。5.3.1.2试剂
5.3.1.2.1IFA诊断板的制备：参见附录C5.3.1.2.2兔抗猪异硫氰酸荧光素（FITC)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清.由国家指定单位提供。
5.3.1.3样品
采集被检猪血液，分离血清.血清应新鲜、透明、不溶血、无污染密装于灭菌小瓶内，4℃或一30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS液作20倍稀释。5.3.2操作方法
5.3.2.1取IFA诊断板，编号，弃去板中的乙醇溶液，置超净工作台中风干，每孔加100μLPBS液洗1次，弃去PBS液并在吸水纸上轻轻拍干。5.3.2.2在编号对应的孔内加入20倍稀释的被检血清：同一排相邻的感染细胞孔2个及其后感染细胞孔1个，每孔100L，同时作标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用PBS液代替血清。置37℃恒温箱中感作45min。
5.3.2.3弃去板中血清，用PBS液洗板4次，每孔100μL，每次3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。5.3.2.4每孔加人工作浓度的免抗猪FITC结合物50uL，在37℃恒温箱中感作45min。5.3.2.5弃去板中液体，用PBS液洗板4次，方法同5.3.2.3。3
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5.3.3荧光显微镜检查及判定与解释荧光显微镜采用蓝紫光（激发滤板通常用BG12.吸收滤板用OG1或GG9），在50倍～100倍下检查。标准阳性血清对照中感染细胞孔（P·V十）应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔（P·V一）不应出现特异性荧光，标准阴性血清对照、空白对照中感染细胞孔（N·V十）和未感染细胞孔(N.V一)均不应出现特异性荧光：被检血清对照中未感染细胞孔（C·V一）不应出现特异性荧光。被检血清样品感染细胞孔（N·V+）出现特异性胞浆亮绿色荧光判为阳性；否则，判为阴性、5.4间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA)（见GB/T18090）5.4.1材料准备
5.4.1.1器材
96孔平底微量反应板、微量移液器、酶标仪、恒温箱、保湿盒等。5.4.1.2试剂
5.4.1.2.1PRRS病毒抗原和正常细胞对照抗原，由国家指定单位提供。使用前，按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度。
5.4.1.2.2免抗猪IgG辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。5.4.1.2.3PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。
5.4.1.2.4抗原稀释液、血清稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液等，参照附录B自行配制。5.4.1.3样品
采集被检猪血液分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4C或一30C冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释5.4.2操作方法
5.4.2.1包被抗原：取96孔平底微量反应板，于奇数列加工作浓度的病毒抗原，偶数列加工作浓度的对照抗原，每孔100uL（参见表1），封板，置保湿盒内放37℃恒温箱中感作60min，再移置4℃冰箱内过夜。
间接ELISA诊断板加样表
注：V为PRRS病毒抗原包被列；C为正常细胞抗原包被列；P为标准阳性血清对照孔；N为标准阴性血清对照孔：S1、S2、S3等为被检血清编号5.4.2.2
拍干。
洗板：弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔100μL，洗涤3次，每次1min.在吸水纸上轻轻5.4.2.3
3封闭：每孔加人封闭液100uL，封板后置保温盒内37C恒温箱感作60min。4
5.4.2.4洗涤：方法同5.4.2.2
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5.4.2.5加血清：反应板按表1编号后，对号加入已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。每份血清各加两个病毒抗原孔和两个对照抗原孔，孔位相邻。每孔加样量均为100L。封板，置保湿盒内于37℃恒温箱中感作15min。5.4.2.6洗板：方法同5.4.2.2。5.4.2.7
加酶标抗体：每孔加工作浓度的酶标抗体100uL.封板，放保温盒内置37C恒温箱中感作15min。
5.4.2.8洗板：方法同5.4.2.2。5.4.2.9加底物：每孔加人新配制的底物溶液100uL，封板，在37℃恒温箱中感作15min。5.4.2.10加终止液：每孔添加终止液100μL终止反应。5.4.3光密度（OD)值测定与计算5.4.3.1OD值测定
在酶标测定仪上用入=650nm读取反应板各孔溶液的OD值，记人专用表格。5.4.3.2OD值计算
按下式分别计算标准阳性血清、标准阴性血清和被检血清与2个平行抗原孔反应的OD值的平均值。
标准阳性血清(P)与病毒抗原(V)反应的均值P：V(OD65）按式(1)计算：P. V=(Ar+B)/2
式中：
阳性血清对照OD平均值；
A—A,孔OD值；
B,孔OD值。
标准阳性血清(P)与对照抗原(C)反应的均值P·C(OD65）按式(2)计算：P.C=(A, +B,)/2
式中：
P·C-阳性血清空白对照OD平均值；A—A孔OD值；
BB孔OD值。
标准阴性血清(N)与病毒抗原(V)反应的均值N·V(ODso)按式(3)计算：N: V=(C+D)/2
式中：
阴性血清对照OD平均值；
C——C孔OD值；
DD孔OD值。
被检血清（S)与病毒抗原(V)反应的均值S·V(ODs5）按式（4)计算（以S1血清为例）：S.V= (E+F)/2
式中：
被检血清(S)与病毒抗原(V)反应的OD平均值：EE孔OD值；
FF孔OD值
被检血清（S)与对照抗原(C)反应的均值S·C(OD5a）按式(5)计算（以S1血清为例）：...1)
（3）
（4）
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式中：
S.C=(E, +F2)/2
S·C-被检血清(S)与对照抗原(C)反应的OD平均值；E2——E孔OD值；
F2——F孔OD值。
5.4.3.3被检血清OD值与标准阳性血清OD值的比值S/P按式（6)计算：S/P=(S.V-S.C)/(P.V-P.C)
式中：
S/P——被检血清OD值与标准阳性血清OD值的比值。5.4.4结果的判定与解释
5.4.4.1有效性判定
....(6)
P.V(ODs）与N.V(OD5）的差值应大于或等于0.150时，才可进行结果判定。否则，本次试验无效。
5.4.4.2判定标准与解释
S/P比值小于0.3，判定为PRRS病毒抗体阴性，记作间接ELISA（一）S/P比值大于或等于0.3，小于0.4，判定为疑似，记作间接ELISA（士）。S/P比值大于或等于0.4，判定为PRRS病毒抗体阳性，记作间接ELISA（+）。间接ELISA（十）者表明被检猪血清中含有PRRS病毒抗体。5.5血清中和试验（SN)（见GB/T18090）5.5.1材料准备
5.5.1.1器材
96孔细胞培养板、微量移液器、二氧化碳恒温箱、倒置显微镜等。5.5. 1.2病毒
美洲标准株ATTCVR-2332或欧洲标准株LV.由国家指定单位提供。使用前参照附录D方法滴定病毒效价后，用含20%健康猪新鲜血清的EMEM营养液（pH7.2）将其稀释至200TCIDs./25uL，作为工作病毒液。
5.5.1.3细胞
MARC-145或HS2H传代细胞，由国家指定单位提供。使用时，用细胞分散液消化、分散细胞，计数，再用EMEM营养液（含牛血清10%，青霉素100IU/mL，链毒素100μg/mL，pH7.2）稀释至1X10°个/mL
5.5.1.4试剂
PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供，使用前经56C灭活30min，并按说明书规定进行稀释。
5.5.1.5样品
无菌采集被检猪血清，血清应新鲜、透明、无溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃保存或立即送检，检测的经56℃灭活30min。由于中和抗体产生稍晚，故该血清以在疾病中后期或病毒感染后2周～3周时采集为宜。
5.5.2操作方法
5.5.2.1加营养液：取96孔细胞培养液，编号，于各血清检测孔内加人EMEM营养液（含10%特牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素，pH7.2)25uL，细胞对照区各孔加50μL病毒对照区各孔不加。
5.5.2.2加被检血清：用微量移液器精确吸取已作灭活处理的被检血清，在各排头两孔各加入25μL。每份被检血清应平行安排两排，即每个稀释度两孔。6
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5.5.2.3稀释被检血清：从第2列开始依次向后将被检血清作倍比稀释，使第2、3、4、5、6列孔的血清稀释倍数依次为21、22、2″、2、2″。稀释时.用8道微量移液器先在第2列孔内吹吸数次，充分混匀后吸取25μuL移人第3列，同前混勾后取25μL移人第4列，依次稀释，当第6列各孔混匀后，各吸取25μL弃去，稀释过程中切勿产生气泡5.5.2.4稀释对照血清：同5.5.2.3法进行标准阳性血清和标准阴性血清稀释5.5.2.5加病毒液：除血清对照、病毒对照和细胞对照外，各孔添加含20%健康猪新鲜血清EMEM营养液，将病毒液稀释成200TCIDs/25μuL工作病毒液25μL。5.5.2.6病毒对照：取灭菌试管4支，用20%健康猪新鲜血清EMEM营养液（pH7.2)将病毒液稀释至含毒量为200TCID50/25uL、20TCIDs/25uL2TCID/25uL和0.2TCID/25uL4个滴度，然后各取25L加入相应的孔内（每个滴度4个孔），再于各孔内加入25μL2倍稀释的标准阴性血清，此时，病毒浓度分别降为100TCIDs/25μL、10TCID5a/25μL、1TCID5/25μL和0.1TCIDso/25μL。5.5.2.7中和感作：将培养板放入37C的5%二氧化碳恒湿箱中保湿感作60.min。5.5.2.8添加细胞：于每孔内加人配制好的MARC-145或HS2H细胞悬液50uL5.5.2.9培养：封板后，放入37℃的5%二氧化碳保湿恒温箱内培养。5.5.3观察与记录
在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作用（CPE）。每天观察1次，连续观察5天，并将观察结果记人专用登记表内。PRRS病毒在MARC-145或HS2H细胞上生长，引起的CPE主要表现为：细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落5.5.4：中和效价计算和结果判定在各对照组符合下述要求时，本次中和试验才成立：a）病毒对照：病毒浓度为0.1TCIDs的各孔不应出现CPE，100TCIDs的各孔均应出现CPE。b）血清毒性对照：相当于试验中最低稀释度（本标准中为2倍)的被检血清对细胞应没有任何毒性作用：
细胞对照：在整个试验中应一直保持良好的形态和特征。）
阳性血清对照：试验中所显示的能抑制CPE出现的血清最高稀释度不应比其已知滴度差1个d)
滴度以上。
阴性血清对照：各稀释度应出现CPE。对被检血清的中和效价进行计算，其血清中和效价为能抑制平行两孔或两孔中一孔出现CPE的血清最高稀释倍数的倒数。血清中和效价大于或等于1：4.判定为血清中和试验阳性，记作SN（十）；小于1：4，判为阴性.记作SN（一）。SN（十）表示被检猪血清中含有PRRS病毒抗体。SN/T1247—2007
附录A
（资料性附录）
疾病概述
A.1猪繁殖和呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）也称为蓝耳病（Blue-earedDisease），是由猪繁殖和呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪及育成猪呼吸困难为特征的接触性传染病。
A.2病原
PRRSV属于动脉炎病毒科（Arteriviridae)动脉炎病毒属的成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球型，直径为55nm～60nm。PRRSV专嗜在猪肺泡巨噬细胞内生长，在传代细胞系CL2621和Marc-145、HS2H中亦可生长繁殖，且可产生明显的细胞病变；PRRSV不凝集红细胞，无血凝活性；其对pH值及温度变化非常敏感，pH值大于7或小于5时其感染性降低90%以上，对碱耐受性极差·pH5.5～6.6为其保存最适pH值，室温及37℃以下迅速失活.56℃45min即被完全灭活；对消毒剂抵抗力不强。
根据基因的变异程度，自前将PRRSV分为两种主要抗原型：分别以LV和VR-2332为代表株的欧洲型和美洲型，据现有资料，我国流行的毒株为美洲型。PRRSV有3种主要结构蛋白：分子量为15X10\的核衣壳蛋白（N）、18X10\的基质蛋白（M)和25X10\的囊膜蛋白（E）。其中N蛋白免疫原性最强，在PRRSV感染猪体时，所有感染猪在7d后都能检测到抗N抗体。A.3流行病学
PRRSV的主要传播途径是接触传染，可通过空气和精液传播，传播途径多、传播速度快，可在猪群中长期持续感染，猪是唯一感染PRRSV并出现临床症状的动物。研究表明：精液中需要一定数量的病毒才能感染母猪，公猪受感染后排毒可达90d之久。将感染猪特别是隐性感染猪引入易感猪群是该病流行的重要原因。在妊娠早期，病毒可通过胎盘感染胎儿，妊娠中期病毒很难通过胎盘而感染胎儿。该病遍布于全世界主要养猪地区，于20世纪80年代在北美和欧洲大面积爆发流行，20世纪90年代中期传人我国。
A.4症状
本病临床症状主要表现为死胎率和乳仔猪死亡率较高。母猪感染PRRSV后，妊娠母猪表现发热厌食、流产、死胎、弱仔等。新生仔猪：呼吸困难，伴有共济失调、发热、厌食、腹泻、昏睡和精神不振等症状，产后一周内死亡率明显增高。仔猪：以一月龄内仔猪最易感并表现典型的临床症状，体温升高，呼吸困难，食欲减退或废绝，腹泻，被毛粗乱，后腿及肌肉震颤，共济失调，渐进消瘦，眼脸水肿，死亡率高。育肥猪：育肥猪对本病易感性较差，呈现厌食及轻度呼吸困难，少数病例表现咳嗽及双耳背面、边缘及尾部皮肤出现深青紫色斑块。公猪：发病率较低，症状表现厌食、呼吸加快、咳嗽、消瘦、昏睡及精液质量明显下降，个别公猪出现双耳皮肤变色，A.5发病机理和病理变化
感染猪若干星期内抗体存在的同时出现毒血症，已证实抗体可增强病毒感染，亚中和滴度的IgG有助于发病，病毒可穿过胎盘感染猪患，导致脐带出血性病变，病毒感染单核细胞及巨噬细胞，造成免疫SN/T 1247—2007
抑制。本病的病理变化不明显，仔猪和小猪常能观察到由PRRSV感染引起的病理解剖和病理组织学变化。头部、耳廓、颈部发，头部水肿。淋巴结肿大，下颌淋巴结、肠淋巴结、腹股沟淋巴结最为明显。肺脏不同程度硬化，红褐花斑状，感染部位与健部界线不明显，胸腔内有大量的液体。组织病理检查呈间质性肺炎。
A.6检疫及诊断
根据妊娠母猪表现发热、流产、死胎、弱仔及仔猪发热、呼吸困难、死亡率明显增高。头部、耳廓、颈部发，淋巴结肿大，间质性肺炎等症状和病理变化可以做出初步诊断，进一步确诊应依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接免疫荧光试验（IFA）、间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）和血清中和试验（SN）等，病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。其余4种方法主要用于检测PRRS病毒抗体。IPMA、IFA和间接ELISA三者特异性相似，但以间接ELISA的敏感性最高。应用这三种方法一般不易区别病毒的抗原类型，故多适用于确定病性。SN反应具有明显的抗原型别差异，因此，它既适用于确定病性，也适用于鉴定病毒的抗原类型。因中和抗体出现最晚，SN不适于早期诊断。A.7综合判定
当在临床上怀疑有PRRS病毒感染时，可根据实际情况，由上述五种方法中选用一种或两种方法进行确诊。对于未接种过PRRS疫苗或已超疫苗免疫保护期的猪，经任何一种方法检测呈现阳性结果时，都可最终判定为PRRS病毒感染猪。对接种过PRRS灭活疫苗并在疫苗免疫期内的猪，病毒分离鉴定试验为阳性结果时，可终判为PRRS病毒感染猪；当仅血清学试验呈阳性结果时·应结合病史和疫苗接种史进行综合判定，不可一律视为PRRS病毒感染猪。9
SN/T1247-2007
附录B
（资料性附录）
血清学试验中试剂的配制
B.1PBS液(0.0lmol/LPBS,pH7.2）用于IFA，氯化钠（NaCI)8g，氯化钾（KCI)0.2g，碳酸氢钠（NaHCO）1.15g，磷酸二氢钾（KH,PO)0.2g，三蒸水加至1000mL，保存于4C备用。B.2洗涤液（0.01mol/LPBS-0.05%吐温-20.pH7.4）用于IPMA和间接ELISA，磷酸二氢钾（KH,PO,)0.2g，磷酸氢二钠（NazHPO，：12H2O)2.9g氯化钠（NaCI)8.0g，氯化钾（KCI)0.2g，吐温-200.5mL，三蒸水加至1000mL，现用现配B.3抗原稀释液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液·pH9.6）用于间接ELISA，碳酸钠（NazCO）1.59g，碳酸氢钠（NaHCO）2.93g，三蒸水加至1000mL，4保存，一周内用完。
B.4血清稀释液
用于IPMA和ELISA，为含1%牛血清的\B.1液。B.5封闭液
用于间接ELISA，为含1%特牛血清白蛋白或10%马血清的\A.1液B.6显色/底物溶液
用于IPMA。
B.6.1AEC贮存液
称取氨乙基味唑（3-amino-9-ethyl-earbazole，AEC）4mg溶于二甲基甲酰胺（N，N-dimethy-formamid)4mL中，充分溶解后置4C避光保存。B.6.2乙酸钠溶液
乙酸钠（CH.COONa)4.15g，加三蒸水至1000mL，用冰乙酸调整至pH5.0B.6.3乙酸盐缓冲液
冰乙酸（CHCOOH)12.8mL，乙酸钠溶液35.2mL。B.6.4显示/底物溶液（AEC-H,O,）乙酸盐缓冲液19mL，AEC贮存液1mL,30%过氧化氢（H,O,)0.067mL，充分混合后装于褐色玻璃瓶内避光存放。现用现配。
B.7底物溶液（用于间接ELISA）B.7.10.1mol/L柠檬酸溶液
柠檬酸（C,H.O,)1.92g，加三蒸水至100mL。B.7.20.1mol/L磷酸氢二钠溶液
磷酸氢二钠（NazHPO,·12H,O)3.58g，加三蒸水至100mL10
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