【国家标准(GB)】 生活饮用水标准检验方法 微生物指标

ICS 13. 060
中华人民共和国国家标准
GB/T 5750.12--2006
部分代替GB/T5750—1985
生活饮用水标准检验方法
微生物指标
Standard exanination methods for drinking water-Microbiological parameters
2006-12-29 发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2007-07-01实施
GB/T 5750.122006
......
菌游总数
总大肠菌群
耐热大肠菌群
大肠埃希氏菌
贾第輪毛虫·
隐孢子业…
GB/T5750&生活饮用水标准检验方法》分为以下部分：总则：
水样的采集和保存；
一水质分析质敏控制：
感官性状和物理指标；
：一无机非金属指标：
—金属指标：
有机物综台指标；
——有机物指标;
—农药指标；
一消毒副产物指标：
一消声剂指标；
--微生物指标；
一改射性指标。
GB/T 5750.12—2006
本标准代替GB/T5750-1985%生活饮用水标准检验法》第二篇中的细菌总数、总大肠菌群：本标准与GB/T5750-1985相比主要变化如下：依据GB/T1.1-2000次标准化工作导则，第1部分：标准的结构和编写规则》调整了结构，-—一增了生活饮用水中耐热大肠菌群,大肠埃希氏菌,贾第鞭毛虫、隐抱子虫 4 项指标的 7个检验方法。
本标准由中华人民共和国』生部提出并归口。本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所。本标准参加起草单位：中山大学、黑龙江省疾病预防控制中心、河北省疾病预防控制中心、北京市疾病预防控制中心、深市疾病预防格制中心澳门白来水公司、广州市来水公司。本标雄主要起草人：金银龙、陈西平、周淑求、孙宗科、米宏。本标准参加起学人：迥晓杰，张淑红、张雅樊、丁培、薛金某、余潮苑、范晓军、章诗芳.本标准于1985年8月首次发布，本次为第一次修订。1菌落总数
1.1平血计数法
1. 1. 1 范围
生活饮用水标准检验方法
微生物指标
本标准规定了用平血计数法测定生活饮用水及其水源水中的菌落总数。本法适用于生饮用水及其水源水中菌落总数的测定。1.1.2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。1. 1. 2. 1
菌落总数 standard plate-count bacteriaGB/T 5750.12-2006
水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养4&h后-所得1 m.水择所含菌落的总数。1. 1. 3培养基与试剂
1.1.3.1营养琼脂
1.1.3.1.1成分：
蛋门陈
牛肉膏
氯化钠
燕馏水
10g~-20g
I 800 ml.
制法:将上述分混分后,加热解,调整 PH为 7. 4-7. 6,分装于玻璃容器中(如用含杂1. 1. 3. 1. 2
质较多的琼脂时，应先过滤）,经103.43kPa （121℃，151h)灭菌20 min,储存于冷暗处备用1.1.4仪器
高压蒸汽火菌器。
1. 1. 4. 1
1.1.4.2干热灭菌箱。
培养箱36℃1℃
1. 1. 4. 3
1. 1. 4. 4
电炉。
1. 1, 4. 5
1.1.4.6冰箱。
1.1.4.7放大镜或菌落计数器.
1. 1. 4. 8 pH 计或精密 μH 试纸。1.1.4.9灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等：1. 1.5检验步骤
1.1.5.1生活饮用水
1.1.5.1.1以无的操作方法用灭菌吸管吸敢1mL充分混均的水样，注人灭菌平中，倾注约15mI已融化并冷却到45℃在右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平血，使水样与培养基充分混勾。每次检验时应做一平行接种,同时另用个平Ⅲ只颁注营养琼脂培养基作为空白对照。1. 1. 5. 1.2待冷却凝固后,翻转平血,使底而向上，置于36℃土1℃培养籍内培养 48 h,进行菌落计数1
GB/T 5750.12—2006
即为水样1mT.中的菌落总数。
1.1.5.2水源水
1.1.5.2.1以无菌操作方法吸取」ml.充分混勾的水样，注人盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混勾成1：10稀液，
1.1.5.2.2吸取1：10的蒂释液1mL注入盛有mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1：100稀释液，按同法依次稀释成11000.110000稀释液等备用。如此递增稀释一次，必须更换，支1ml灭菌吸梵，
1.1.5.2.3用火菌吸管取末稀释的水样和12个～3个适宜稀释度的水样1ml.分别注人灭菌平血内，以下操作同生活饮用水的检验步骤，1.1.6菌落计数及报告方法
作平菌落计数时，可用眼随直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏，在记下各平Ⅲ的菌落数后,应求出同稀释度的平均菌落数,供下一步计算时应用。在求间稀释度的平均数时,若其中一个平血有较大比状菌落生长时，则不亢采用而应以无片状菌落上长的平血作为该稀释度的平均菌落数。若片状南落不到平血的半，而其余一半中菌落数分布义很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全Ⅲ菌落数。然后再求该稀释度的平均齿落数。1.1.7不同稀释魔的选择及报告方法1.1.7.1首先选择平均菌落数在30~300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此池国时,则将该菌弊数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例1)。1.1.7.2若有两个稀释度,其生长的菌落数均在30~300之间：则视二者之比来决定若其比值小F2应报告两者的平均数（如表1中实例2，若大于2则报告其巾稀释度较小的菌落总数（如表1中实例)。若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数（见表1中实例4)。1.1.7.3若所有希释度的平均菌落数均大于300,划应按稀释度最高的平均断落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例5）
1.1.7.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应以按稀释度最低的平均函落数乘以稀释倍数报告之（见表1巾实例6)
1.1.7.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间.则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例7)。1.1.7.6若所有稀释度的半板上均无菌落生长，以未检出报之。1.1.7.7如果所有平板上都菌落密布，不要用\多不可计\报告，而虚在稀释度最人的平板上，任意数其中2 个乎板1 cm中的菌落数,除2求出每乎厘来内平均菌落数,乘以而底而积63,6 cm*再乘其帮释倍数作报告
1.1.7.B菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，人于100时，采用两有效数字,在两位有效数字后面的数值，以四舍五人方法计算，为了缩短数字后面的零数地可用10的指数来表示（见表1\报告方式\栏）
表 1稀释度选择及菌落总数报告方式实例
不间稀释度的平均函将数
两个帮释度
菌落总数！
荫落数之比
(CFU/ml.)
16 400
报告方式(CFU/ml)
16 000 或 1. 6×10
38 000 或 3. 8× [0
27 000 或 2, 7×10
1 500或1,×103
不同稀释度的菌数
多可计
表不可计
2总大肠菌群
2.1多管发酵法
2. 1. 1范围
表1(绥）
两个释度
菌落数之比
菊落总数
(CFU/mL)!
513 000
30 500
本标准规定了用多臂发酵法测定生活饮用水皮其水源水中的总大肠菌群。本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。2. 1. 2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。2. 1. 2. 1
总大肠茵群totalcoliforms
GB/T 5750.122006
报告方式CFU/mL)
510 00 或 5. 1×10
270 或 2. 7×10
31 000 或 3. 1×10
总人肠菌样指--群在37C培养24 h能发酵乳糖、产载产气需氧和兼性庆氧的革兰氏阴性无芽孢杯菌。
2.1.3培养基与试剂
2.1.3.1乳糖蛋白陈培养液
2.1.3.1.1成分
A蛋H陈
D氯化钠
E漠甲紫乙醇溶液(16 g/L)
F淼馏水
2. 1. 3. 1. 2 制法
1 000 ml
将蛋凹陈、牛肉膏、乳糖及氯化钠落于蒸馏水中，调整pI为7.2~7.1,再加人1ml.16g/L的溴甲酸紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有例管的试管巾中，68.95kPa（115℃101b）高压灭菌20min，死存寸疫暗处备用。
2.1.3.2三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液按上述乳糖蛋白陈培养液（2.1.3.1),除蒸馏水外，其他成分鼠加倍，2.1.3.3伊红美蓝培养基
2.1.3.3.1或分
A蛋白陈
B乳糖
磷酸氢二钾
）琼脂
E蒸馏水
F伊红水溶液(20g/1.)
20 g--30 g
1000mL
GB/T 5750.12—2006
G美蓝水溶液(5 R/L)
2. 1. 3. 3. 2制法
将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于热馏水中，校正pH为7.2.加入乳榜.混勾后分装，以68.95kPa（115℃101h）高压灭菌20min，临用时加热融化琼脂，冷至50℃~55℃，加入伊红和美蓝溶液、混匀，懒注平，
2.1.3.4革兰氏染色液
2. 1.3. 4. 1结晶紫染色液
A成分：
结晶紫
b乙醇(95，体积分数）
草酸铵水液(10R/L)
H制法：将结品紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。注：结晶紫不可用龙肌紫代替,前者是纯品,后者不是单一成分,易出现阳性。结晶紫溶液故置过久会产生沉淀、不能再用。
2.1.3.4.2革兰氏碘液
A成分：
b碘化钾
蒸馏水
B制法：将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸增水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水2. 1. 3.4. 3脱色剂
乙醇（95%，体积分数），
2.1.3.4.4沙黄复染液
A放分：
a沙黄
b乙醇（95%，体积分数）
蒸馏水
B制法:将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加人燕馏水。2.1. 3. 4. 5染色法
A将培养18b~21h的培养物涂片.
B，将涂片在火焰上固定,滴加结品紫染色液,染1 min,水洗，滴加兰氏碘液，作用「min.水洗，D滴加脱色剂.播动玻片，直至无紫色脱落为止,约30 s,水洗。E滴加复染剂，复染1nin，水洗.待干，镜检。2.1.4器
2.1.4.1 培养箱:36%℃±1℃。
冰箱:0℃~1℃。
2. 1. 4.2
2. 1. 4. 3 天平。
2. 1. 4. 4
2. 1. 4. 5
显微镜。
平皿：直径为9cm。
2.1.4.6试管，
2. 1, 4. 7
分度吸管:1 mL,10 mL，
2.1.4.8锥形瓶
2. 1.4.9小侧管。
2.1.4.10载玻片，
2.1.5检验步骤www.bzxz.net
2.1.5.1乳糖发酵试验
GB/T 5750.12—2006
2.1.5.1.1取10ml.水样接种到10ml.双料乳糖蛋白陈培养液中,取1mL水样接种到10m[.单料乳糖蛋白陈培养液中，另取1ml.水样注人列9mL灭菌生理盐水中，混句后吸取1ml.(即0.1ml水样）注人到10mI.单料乳糖蛋白陈培养液中，每一稀释度接种5管。对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10mL水样双料培养基，每份接种10 水样。
2.1.5.1.2检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释变，可接种1，0.1,0.01mL甚至0.1，0.01，0. (001 m[.,每个稀释度接种 5 管,每个水样其接种15 。接种 mI. 以下水样时-必须作 TO 倍递增稀释后,取」ml.接种,每递增稀释-次,换用1支」ml.灭菌刻度吸管、2. 1. 5. 1. 3 将接种管置 36℃ 二1℃ 培养箱内.培养 24 h土2 h.如所有乳糖蛋白陈培养管部不产气产酸·则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。2. 1. 5, 2分离培养
将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美监琼脂平板上,于 36℃ =1r:培养箱内培养 1&h~～24h,观察菌落形态，挑取符合下刻特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验深紫熙色、具有金属光泽的荫落：紫黑色,不带或咯带金属光洋的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落。
2. 1. 5. 3证实试验
经上述染色镜检为草兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖强凸陈培养没，置36℃1:培养箱中培养 21 h士2 h,有产酸产气者,即证实有总大肠随样存在。2. 1. 6 结果报告
根据证实为总大肠菌群阳性的管数,套 MPN(must prob:ihlc nuinbei,最可能数)检索表,报告每100mT.水样中的总人肠菌群最可能数(MPN)值：5法结果见表2,15管法结果见表3。稀释样品查表后所得结果成乘稀释倍数，如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。表 2用 5份 10 mL 水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数(MPN)5 个 10 ml. 管中性骨数
最可能数（MIN）
GB/T5750.12-2006
表3总大肠画群MPN检索表
（总接种量55.5ml.其中5份1）ml.水样，5份1ml水样，5份0.1mL水样）总人肠萄群/
接种壁/mL
总大肠菌群！
接种量/ml.
(MIN?100 nl.?
(MPN/1o0 mI.)
GB/T 5750.12-2006
表3（续）
总大肠南群/
(MPN/100 mL)
(MPN/10CmJ.)
总大滴菌群/
接种最ml
GB/T 5750.12-—2006
表3（续）
总人肠储群
接种量/ml.
总大肠菌！
接种基/mL.
(MIN/I50 mL)
(MPN/:00 ml)
2.2滤膜法
2.2. 1范围
本标准观定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的总人肠菌群。本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌样的测定。2.2. 2术语和定义
下列术评和定义适用于本标准。2.2.2.1
总大肠菌群滤膜法membrane filter technique for total colifurnrsGB/T 5750.12—2006
总大肠菌群滤膜汰是指用孔径为U.4I1m的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上37℃培养24 h,能形成持征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无茅胞杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。
2.2.3培养基与试剂
2.2. 3.1品红亚硫酸钠培养基
2.2.3.1.1成分
A蛋白陈
B酵丹浸膏
C牛肉膏
1）乳糖
E琼脂
F磷麟酸氨二钾
无水亚硫酸钠
H碱性品红乙醇溶液(50gL)
1蒸馏水
2.2.3.1.2储备培养基的制备
15 R~-20 g
1000ml
先将脂圳到5Ⅲ粪馏水中，煮沸辫解，干另50游馏水中加人避酵氢二钾，蛋白藤、醉母没肾和4肉潜，热落解，倒人已溶解的晾脂.补足蒸馏水至100mL，混讨后调PH为7.2-7，1，再加人乳糖，分装,68.95 kPa（1[5,10「h)高压灭菌20 min,储存于冷暗处备用。本培养基也可不加琼脂，制成被体培养基，使用吋加2 i～3mL-于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养热上培养
2.2. 3. 1. 3、平血培养基的配制将法制备的储备培养基加热融化，用灭菌啵管按比例吸取-定量的50名/L的碱性品红乙醇溶液置下火菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一火菌试管中，加火菌水少许，使其溶解后，沸水莽帅煮沸l0 min以火菌用灭菌吸管吸取已灭菌的业碗酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）,立即将此种培养基15㎡L倾人山灭菌的空平皿内。待冷却凝固后冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不定超过两周。如培养基己由淡粉色变成深红色，则不能再用，2.2. 3.2乳糖蛋白陈培养液
同 2. 1. 3. 1
2.2.4仪器
2.2.4. 1滤器。
2.2.4.2滤膜，孔径0.45Am
2.2.4.3抛滤设备
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