【国家标准(GB)】 猪源链球菌通用荧光PCR检测方法

ICS 07. 100. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T19915.6—2005
猪源链球菌通用荧光PCR检测方法Method of the real-time PCR for the detection of Streptococcus suis2005-09-27发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2005-11-01实施
..com前言
本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出：本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。GB/T19915.6—2005
本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，中国兽医药品监察所本标准生要起草人：张鹤晓、宋立，高志强、宁宜宝、周琦，乔彩霞、杨承槐、吴丹、谷强。本标准系首次发布的国家标推。w1范围
猪源链球菌通用荧光PCR检测方法本标准规定了猪源链球菌通用荧光PCR检测方法，GB/T19915.6—2005
本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子，猪组织样品中猪源链球菌的检。2规范性引用文件
下列文件中的条款过本标准的引用而成为本标推的案款。凡是注白期的引用文样，其随后所有的修改单（不每括勘误的内容）或餐订版均不适用于本标推，然而，鼓励根据本标推送成协设的客方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注期的引用文件，其最新版本适用于本标准，GB/119438.1一2004流感病毒通用荧光R1-ICR检遇方法3缩略语
本标准采用下列缩略语：
荧光PCR荧光聚合酶键链式反应
Taq酶
4原理
每个反应管内的荧光信导量达到设的阅值时所经历的循环圈数脱氨核糖核酸
TagDNA聚合酶
磷酸盐缦冲生理盐水
采用TaqMan方法·在比对猪源链球菌16SrDNA基因序列的基础上，设计针对该基因的特异性物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针：5'端标记FAM荧光豪为报告荧光基团（用R表示）：3'端标记TAMRA荧光素为猝灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5°端荧光基团发出的荧光信号。PCR反应进人退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发比的炎光信号被Q.基团所吸收，仪器检测不到荧光信号而反应进行到延伸阶段时，TaQ酶的5\3”的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随誉PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5猎源链球菌通用荧光PCR检测实验率的标准化设置与管理猪源链球菌通用荧光PCR检测实验室的标准化设与管理见GB/\°19438.12004中附录C。6试剂和材料
6. 1 试剂
除另有说明，所用试剂均为分析纯。6. 1. 1 无水艺醇; 一20 C预羚。6.1.275%乙醇：用新开启的无水乙醇和无DNA酶的灭菌纯化水配制，一20℃预冷。6.1.30.01mol/LpII7.2的PBS：配方见附录A，(121土2）℃、15min商压灭菌冷却，GB/T 19915.6—2005
6.1.4猪源链球菌通用荧光PCR检测试剂盒：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B。6.2器设备
6. 2.商速台式玲冻离心机:最大转速 13 000 1/min以上。6. 2. 2荧光 PCR检测仪,计算机。6.2.32℃～8℃冰箱和—20℃箱。6.2.4微移镀器:0.5 μL~10 μL,5μL~20 μL,20 μI.~200 μL,200 ±L~1 000 μL.6.2.5组织匀浆器。
6.2.6混匀器。
7样品的采集与前处理
采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须巅一饮性手套。7.1取样工具
7. 1. 1 棉拭子,剪力、缓子,研钵,Eppendorf 管。7.1.2所有上述取样工具应经（121士2）℃、15min高压灭菌并烘干或经160C干烤2h，7.2采样方法
7.2.1生猪拭子样品
咽喉拭子来样，来样时要将拭子深人喉头及上来回刮3次～5次，取咽喉分秘液。7, 2,2 痛机体,内脏或脏肉样品用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 1. 0 g 于研钵中充分研磨,再加 5. 0 mL PBS 混勾,然后将组织悬液转人无菌Eppendorf管中，编号备用，7.2.3血清或血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编凸备用7.3存放与运送
采集或处埋的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存，须效量一70℃冰箱但应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品离封后，采用保温查或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。
8摄作方法
8.1样本核酸的提取
在样本处理区进行。
8.1.1提取方法1
8. 1. 1. 1 取 z 个 1. 5 mL 灭菌 Eppendorf 管,其中 n 为待检样品数.一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
8. 1. 1.2每臂加人 1.0 ml. 裂解液,然后分别加人待测样本、阴性对和阳性对照各 100 μL,-份样本换用一个吸头，混匀器上腰满混勾5s.于4℃～25℃条件下，10000r/min离心10tmin。8. 1,1. 3取与 8.1. 1, 1 中相同数量的 1, mL 灭菌 Eppendorf 管,加人 500 μL 无水乙醇(20℃ 现玲）,对每个管进行编号。吸取8.1.1.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液要充分吸取，不要吸出底部沉淀，颠倒混匀。8. 1. 1. 4于 4℃ ～25℃ 条件下,5 000 r/min 离心 5 min(Eppendorf 管开口保持期离心机转轴方向放置)。轻轻倒去,工清,倒置于吸水纸上,吸于液体,不尚样品应在吸水纸不同地方吸牛。加人1. 0 mI1）由指定单位提供,给出这一信息是为了方本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具存相尚的效果，则可使用这些等效产品。75%乙醇，颠倒洗涤。
GB/T 19915.6—2005
8. 1. 1.5于 4℃-25℃条件下,5 000 r/min离心10 min(Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸十体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。8.1. 1.64 000 r/min 离心10 s,将管壁上的残余液体用到管底部,用徽量加样器尽量将其吸于，一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥 5 ~15 s。不宜过于干燥,以免 DNA不溶。8. 1. 1. 7 期人 11 tI. 无 DNA 醛的灭菌纯化水,轻轻混勾,溶解管壁上的 DNA,2 000 r/min 离心 5 5,冰上保存备用。
8.1.2提取方法2下载标准就来标准下载网
8, 1. 2. 1 取 n 个 1, 5 ml. 灭菌 Eppendlarf 管,其中 n 为待检样晶数、一管游性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
8.1.2.2每管人 100 ±L. DNA提取液 1,然后分别加人待测样本,阴性对照和阳性对照各 100 μL,一份样本换用一个吸头,混句器上覆荡混句 5 s,于 4℃～25℃条件下,13 000 r/min离心10 min。8.1. 2.3尽可能吸弃上清且不碰沉淀,再加人 10 μL DNA提取液 2,混勾器上罹荡混匀 5 s。于 4℃~25℃条件下，2C00r/min离心105。8.1.2.4100C干浴或沸水浴10min，加入40μL无DNA酶的灭菌纯化水，13000z/min离心10min，上清即为提取的DNA，冰上保存备用。8.1.3DNA提取后的处理要求
提取的 INA须在2h内进行 PCR扩增或效置丁7U℃冰箱。8.2扩增试剂准备与配制
在反应混合物配制区进行。
从试剂盒中取出猪源链球菌通用荧光PCR反应液、Tag酶，在室温下融化后，2000r/min离心55。设所 PCR 数为 t,其中 n为待检样品数,-管阳性对照及-管阴性对照之和。每个测试反应体系需使用 15 uL PCR反,应液及 0. 3 μL Tag 酶。计算各试剂的使用量,人一适当体积试管中,间每个 PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区B.3加样
在样本处理区进行。在各设定的 PCR 管中分别如人 8. 1. 1. 7 或者 8. 1. 2. 4 中制备的 DNA 溶液10uL.使总体积达25ul盖紧誉盖后，500r/min离心30s。8. 4荧光 PCR 反应
在检测区进行。将8.3中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内：记录样本摆放顾序。反应参数设置：
—第一阶段，预变性92℃3min:
一第二阶段，92℃5s，60℃305，45个德环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。
9结果判定
9.1结果分析条件设定
读取检测结果。阅值设定原则以阀值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。
9.2质控标准
9.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。9.2.2阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。9.2.3如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。..comGB/T19915.6--2005
9.3结果描述及判定
9.3.1两性
无体并且无扩增曲线，表明样品中无猪源链球菌。9.3.2阳性
Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪源链球菌。w附录A
（规范性附录）
磷酸盐缓冲生理盐水配方
A. 1液(0. 2 mol/E磷酸二氟钠水溶液)GB/T19915.6—-2005
一水合磷酸二氮钠(NaH,PO，·H,0)27.6g+溶于蒸馏水巾，最后稀释室1000mlA, 2 B 液(0, 2 mol/L 磷酸氢,二钠水溶液)七水合磷酸氢二钠(NaHPO,7H,0)53.6 g，［或十二水合磷酸氢二钠(NazHPO,12H,O)71. 6 g或=水合磷酸氢二钠(Naz HPO。2H,0)35. 6 多]加蒸馏水溶解,最后稀释至 1 000 m1-。A.30.01mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲生理盐水的配制0.2mol/LA液
0.2 mal/1.B获
用蒸馏水稀释至 1 000 mL。
36 ml,
..comGB/T 19915.6---2005
附录B
(资料性耐录)
潴源链球菌通用英光 PCR 试剂盒组成、说明及使用时的注意事项8. 1试剂盒的组成
试剂盒的组成见表 B,1。
猪源链球菌通用获光 PCR 试剂查的组成组成(48 tests/盒）
衰解液（携敢方法1)或DNA提取液I(提取方法2),DNA提取获2(据取方法2)
着源链球菌通用荧光 PCR反应液Tay醇(s U/μl.)
无 DNA酶的灭菌纯化水
防性对照
阳性对照
B,2说明
48 rL× I 盒(裂解瘦)戏
5 nLX1 管(DNA提取液 1),
1. 6 mLX1 管(DNA 提取液 2)
750 μL×1管
15 μL×1管
1 mL×1管
1 mL×1管
1 mL×1管
裂解液外观为我绿色，于 4℃C保存;DNA提取获 1,2 为无色液体，一20℃保存。B.2.2无DNA酶的灭菌纯化水，用于溶解提取的DNA。B, 2. 3 PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。B.3使用时的注惠事项
由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染，B. 3. 1
B. 3.2反应液分装时应尽量避免产生气泡,上机前注意捡查各反应管是否盖紫，以免荧光物质泄染仪器。
B. 3. 3除裂解液外,其他试剂一20℃保存,有效期为 6 个月。..com
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