【国家标准(GB)】 猪链球菌2型分离鉴定操作规程

ICS 07. 100. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T19915.2—2005
猪链球菌2型分离鉴定操作规程
Methods for detection nf Streptococcus suis type 22005-09-27发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
:com2005-11-01实施
GB/T19915.2-2005
猪链球菌2型是链球荫属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病·引起猪嫩血症、脑膜炎等。人可通过伤口感染该菌，并导致发病和死亡。建立准确、可靠的检测方法诊断、控制和顾防该菌引致的猪链球菌病的迫切要求。本标准是采用经典的细菌学鉴定方法并结合现代分子生物学技术制定的。本标准的附录A为资料性附录,附录B为规范性附录。本标准山国家标准化管理委员会提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口，本标准由南京农业大学、中华人民共和国江出人境检验检疫局和中国检验检疫科学院负责起肯。本标准主要起草人：陆承平、姚火卷、陈国强、张敬友、张常印、唐黎山、姜焱、王凯民、林祥梅、韩雪清、吴绍强、刘建、贾」乐、梅琳。本标摊为首饮发布。
1范围
猪链球菌2型分离鉴定作规程
本标准规定了猪链球菌2型分离鉴定的操作方法，GB/T 19915.2-—2005
本标准适用丁猪及其产品中猪链球菌2型的分离鉴定，也可用丁送检菌株的鉴定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注期的引用文件、其随后所有的修收单（不包括勘误的内容）修订版均不适用手本标准，然而，破励根措本标谁送成协设的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28：食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682-一1992分析实验室用水规格和试整方法GI3/T 19915. 3猪链球菌 2型 PCR定型检测技术GB/T 19915. 4猪链球术 2 型=重 PCR检测方法GB/T19915.5猪链球菌2型多重PCR检测方法GB/T 19915.7猪链球菌 2型荧光 PCR检测方法GB/T19915.8猪链球菌2型毒力因子荧光PCR检测方法GB/T 19915. 9猪链球菌 2型溶血素基因 FCR检测方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
猪链球菌 2 型Streptococcus stuis type 2猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1～34及1/2共35个血清型。猪链球菌2型尼猪链球菌的一个血清型,不对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种要的人奋其患病病源菌。
4摄作规程
4.1方法概要
检验程序的流程示意图见附录A（资料性随录），4.2试剂和材料
除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682一1992的蒸馏水。各种培养基的制备方法见附录B（规范性附录）。4.3仪器和设备
4.3.1匀质器和均质杯。
4.3.2天平：称量范围0g~1000g，读数精度0.1R。4.3.3培养箱：36℃+1℃，bZxz.net
4.3.4恒温水浴锅。
comGB/T 19915.2-2005
4. 4 步骤
4.4.1样品采集
对病猪，最急性和急性病例可无菌来集死亡猪的心、肝,肺、肾、脾、淋巴结等组织，慢性病例如关节炎型一殷采取关节获,及周围组织,对活猪可采取扁桃体子、鼻腔拭子。4.4.2分离培养
4.4.2.1送检菌株的分离
划线接种于普通琼脂绵羊血平板,36'℃土1℃培养 21b±2h如菌落生长缓慢，可延长至 48h二2 h·使之形成单个菌落，以供鉴定用。4. 4.2.2病料的分离和触片检查用经火焰灭菌并冷却的接种环取病料内部组织后划线接种于普適琼脂绵羊血平板，于36土1℃:培养 24 h士2 h,如菌落生长缓慢，可延长至48 h士2 h后观察。同时取病料做组织触片，姬姆萨染色（按G3/T4789.28的方法进行染色）后镜检，如见球菌则表明病料中可能含有链球菌。4.4.2.3扁桃体和鼻腔拭子的分离扁概体和鼻腔拭样品加人到含有 5 mL灭菌的选择性 THB增菌液(见第 B. 4章)的试管中,于36℃士1℃:培养24h士2h后，划线接种于选择性普琼脂绵羊平板（见第B.2章）。4.4.2.4动物产品的均质,增酶和分融以无菌操作取检样25多，明人装有225 tmI.灭菌选摔性 THR增菌液(见第 B.4章）的广口瓶内，均质，于36℃土1℃培养24h士2h后划线接种于选择性普通琼脂绵羊面平板（见第B.2章）。4.4.3初步鉴定
猪链球菌2型在37℃C培养24h后，在普通琼脂缩羊血平板和选摔性普薄琼脂绵羊匪平板1形成圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐，半透明的幕落，直径约0.3mm～1mm，大多数菌株呈α溶血，部分菌株产生 β溶血。
将可疑菌落做苹兰氏染色和过氧化氢酶试验。本菌为革兰氏阳性球菌，菌体肖径约1从m,同体培养物以双球菌为多，少呈3个~-5个排列的短链，液体培养物以链状为主，无芽孢：能形成英膜（按GB/T 4789.28的方法进行染色）。本凿过氧化望酶试验均为阴性。菌落生长特征、革兰氏染色、菌体形态和过氧化氢酶试验符合者，可初步确定为链球菌。4.4.4生化鉴定
经初步鉴定后，做5%乳糖、海藻糖、七叶苷、甘露醇、山梨醇、马尿酸钠等糖发酵试验，猪链球菌2型发酵5%乳糖和海藻糖产酸,发酵-七叶苷,不发酵甘露醇和染醇,不水解马尿酸钠。或应用法国生物-梅里埃公司API20Surep牛化鉴定系统进行生化鉴定。4.4.5玻片凝集试验
将可疑菌荐接种THB肉汤（见第B.3率），于36℃=1℃培养18h士2h，取1.5mL培养物，经10000r/min离心3min，弃上清，用100μl，生理盐水将沉淀悬浮，取25L菌体悬浮液分别和等体积的25uL生理盐水、猪链球菌2型阳性血清作玻片凝集试验，其中生理盐水作为稀释液对照并观察待检菌株是否有自凝现象。同时设阳性菌株对照。在生理盐水对照不凝集巢，阳性菌株凝集的情况下，待检菌株出现凝集为阳性反应。
4.4.6猎链球菌2型定型PCR检测
见GB/T19915.3。
4. 4. 7猪链球菌 2 型毒力因子 PCR 检测必要时进行猪链球菌2型毒力因子PCR检测，PCR检测方法见GB/T19915.4，GB/T19915.5，CB/T19915.7,GB/T19915.8.GB/T19915.9。5试验结果分析判定
5.1符台以下特性者应判为猪链球菌2型：CB/T19915.2--2005
猪链球菌2型在 37℃:培养 24 h后,在普通琼脂编羊血平板和选择性普通琼脂绵羊面平板I:形成圆形、微凸、表面光滑、l润、边缘整齐、半透明的菌落，直径约0.3 Mm～1mm，大多数菌株呈μ溶血,部分菌株产生3溶血;
革氏阳性球菌，单个、成对或成链存在；过氧化氢酶试验阴性：
发酵5%乳糖和海藻糖产酸，发酵七叶苷，不发酵甘露醇和山梨醇，不水解马尿酸钠（本试验项自具有不确定性，整定时供参考），或法国生物-梅里埃公司A1PI20StIe节生化鉴定系统鉴定为猪链球菌2型者：
一与猪链球菌2型阳性血清玻片凝集试验阳性：猪链球菌2型定型 PCR检测阳性。5.2符合以下特性者的菌株可判定为致病性猪链球菌 2 型菌株：符合5.1的特性；
.主要毒力基因(mrp.ef.orf2、sty)全部或之一PcR检测附性。6废弃物处理和防止污染的措施
检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。GB/T 19915.2—2005
(斑料性附录）
猪链球菌2型检验程序
心，肝、肺等病料
普过球脂绵羊血平板
拭子样品
单个。成对、成链的G十辞术，过氧化氧酶阴性發定为链球商
5%乳瓣+、海藻糖+，七叶背+，
甘露醇一、山梨醇一，马尿酸钠—API 20 Strep 签定为 2 型
定型 PCR 检测阳性
链球 2 制
动物产品
瑰择性 71D 增菌液
选挥性管殖琼脂缩羊血乎板
血清凝集试驱阳性
主要毒力因（mrp：cy。ry2、sb）全需联之PCR检测阳性致病性猪链球菌 2 型
图A.1猪链球菌2型检验程序
B.1普通琼脂绵羊血平板
牛肉膏
蛋白陈
氧化钠（NaC1)
磷二氢钾(KH,PO）
蒸馏水
脱纤维光菌绵羊血
附录B
（规范性附录）
各种培养基的配制方法
1 000 mL
GB/T 19915.2—2005
除无菌缩羊血外，混勾，加热溶解,调PH至7.6分装,115℃灭菌15min,冷却至45℃加人5%无菌脱纤维缔羊血倾注灭菌平板。
B.2选择性普通琼腾缔羊血平板
牛肉膏
蛋白陈
氯化钠（aCI)
磷酸\氢钾(KH,PO）
蒸馏水
无菌羊血
叠氮钠
结晶紫
亚硫酸钠
1 000 mL
除无菌绵羊面和结晶紫外，混与，加热溶解.调pH至7.6分装，加人结晶紫（可配成适当溶液)，115℃火菌15min，冷却至46℃加人5%无菌脱纤维绵羊血，混勾,倾灭菌平板。B. 3Todd-Hewitt 肉汤(简称 THB)牛肉膏
耽蛋白藤
葡葡糖
碳酸钠
氯化钠(NaCI)
磷酸氢-钠（NazIPO,）
蒸馏水
0. 4 g;或十二水合磷酸氢二钠(NazHPO, +12Hz))1. 0 g1000 ml
将以上齐成分混合煮沸，究全溶化，冷却至室温后，调pH，于115℃灭菌10min,最终pH为7.8。B,4选择性 Todd-Hewit1 肉汤(简称选择性 THB)牛肉膏
GB/T19915.2—2005
胰蛋白膝
葡药糖
碳酸钠
氯化钠(NaCl)
磷酸氢二钠(Na:HPO,)
叠氮钠
结晶紫
亚硫酸钠
蒸馏水
0. 4 gt或十二水合磷酸氟二钠(Naz HPO, · 12H,O)1. 0 g0.4g
I 000
将以上各成分（结晶紫除外）混合煮沸，完全游化，冷却至室温后，调pH，加入结晶紫（可配成适当溶液),于 115℃灭菌 10 min,最终 pH为 7. 8
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