【国家标准(GB)】 猪链球菌2型荧光PCR检测方法

ICS07.100.30
中华人民共和国国家标准
GB/T 19915.72005
猪链球菌2型荧光PCR检测方法
Method of the real-time PCR for the detection of Streptococcus suis type 22005-09-27发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2005-11-01实施
本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。本标准出国家标准化管理委员会捷出。本标准出全国动物防疫标雅化技术委员会归口，GB/T 19915.7—2005
本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国善医药品监察所。本标准主要起草人：张晓、宋立、高志强、宁宜宝、乔彩覆、王甲正、杨承槐、吴丹、谷强。本标准系育次发布的国家标准。1范
猪球菌2型光PCR检方法
本标推规定了猪链球菌2型获光PCR检测方祛。GB/T19915.7-2005
本标推适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子，猪组织样品中猪链球菌2型的检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而戒为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或够订版均不适用于本标准，然两，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T19438、1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法3缩略语
本标推采下列缩略语：
荧光PCR
Tag酶
4原理
荧光乐合酶链反应
每个反应管内的荧光信号量达到设定的阅值时所经历的循环圈数脱氧核糖核酸
TaQ DNA 乐合酶
磷酸盐缓冲生理盐水
采用TaqMian方法，在比对猪链球菌2型类膜抗原2J基因(cps2J)序列的基础上+设计针对该基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光豪为报告荧光基团（用R表示）3端标记TAMRA荧光索为率灭荧光基团（用Q表示，它在近距离内能吸收5°荧光基团发出的荧光信号。PCR反应进入遗火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合-此时探针上R基团发出的荧光信导被Q基团所吸收，仪器检测不到费光信号，而反应进行到延律阶段时，T&空酶的5→3的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基闭游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随者PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系，5满链球菌之型荧光PCR检测实验查的标准化设置与普理猪链球菌 2型荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理见 GB/T 19438.1一2004中附录 C。6试剂和树料
6.1试剂
除另有说明，所用试剂均为分析纯。6. 1. 1 无水乙醇:一20 ℃磺冷。6.1. 275%乙醇用新并启的无水乙醇和无DNA酶的灭菌纯化水配制，一20 C预冷。6. 1. 30, 01 mo1/L pH7, 2 的 PBS:配方见附录 A,(121士2)C、15 min 商压灭菌冷却。GB/T 19915. 7—2005
6.1.4猪链球菌2型荧光PCR检测试剂盒1，试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录R。6.2器设备
6.2.1高速台式冷冻离心机，最大转速13000r/min以上。6.2.2荧光PCR检测仪、计算机。6.2.32℃～8℃冰箱和-20℃冰箱。6.2.4微量移液器:0. 5 μL~~10 μl,5 μl.~20 μL.20 μl.~~200 uL,200 uL~~1 000 μI.6.2.5组织匀浆器。
6.2.6混勾器。
7样品的采集与前处理
采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中缴戴一次性手套7.1取样工具
7.1.1棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf管。7.1.2所有上述样工具必须经（121士2)℃，15min商压灭脑并烘手或经160C干烤2h。7.2采样方法
7.2.1生猪拭手样品
喉拭子采样，采样时要将拭子深人喉头及上聘来回刮3次～5次，取咽喉分秘液。7. 2. 2病桃体,内脏或肌肉样品用无菌的剪刀和疑于剪取特捡样品 1, 0 g 于研中充分研磨,再加 5. 0 tmL PBS混匀,然后将组织悬获转人无菌Eppendarf 管中，编号备用。7. 2. 3血清或血浆
用无薄注射器直接吸至无菌Eppendar管中，编备用：7. 3存放与运送
采集或处理的样本在2 亡8℃条件下保存应不超过24h:若需长期保存，须放置一70℃冰箱，但应避免反复炼融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温捕加冰密封，尽快运送到实验室。
8作方法
8. 1 样本核酸的握取
在样本处理区进行。
8. 1. 1 提取方法 1
8. 1. 1. 1取 n 个 1, 5 mL 灭菌 Eppendorf +其中 n 为待检样品数、一管阳性对期及一管阴性对照之和，对每个臂进行编号标记。
8. 1. 1.2每管加人 1. 0 mL 裂解液,然后分别加人待测样本、阴性对照和阳性对照各 10 μI. 一份样本换用一个吸头，混匀器上震混勺5s。于4℃~25℃条件下，10000r/min离心10min。8. 1, 1. 3 取与 8. 1. 1. 1 中相同数量的 1. 5 mL 灭菌 Eppendorf 管,加入 500 μl, 无水乙醇(一20 ℃预冷），对每个警进行编号，吸取8.1.1.2离心后各替中的上满液转移至相应的誉中，上清液要充分吸啵敢，不要吸出底部沉凝，题倒混匀。8.1.1.4于4℃~25℃条件下，500ar/min离心5min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放慢)。轻轻倒去上清,倒置于暇永纸上，吸干藏体，不同样品应在吸水纸不尚地方吸干。加人1,0 mL1）由指定单提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品则有相同的效果，删可使用这些等效产品。75%乙醇，顾倒洗涤。
GB/T19915.7—2005
8.1.1.5于4C~25℃条件下，5000x/min离心10min(Eppendorf首开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻衡去上清液，倒置于吸水纸上，吸干获体，不同样品应在吸水纸不地方吸于，8. 1.1. 64 000 r/mim 离心10 s,将管壁上的残余被体用到管底部，用微量加样器尽量将其吸干,份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉裤一一面，室温干爆燥5S～15s，不宜过于干燥，以免DNA不溶。8.1.1.7加入11μL无DNA酶的灭纯化水，轻轻混勾，溶解管壁上的DNA2000r/min离心59，冰上保存备用。
8. 1, 2捷取方法 2
B.1.2. 1取π个1,5 mL灭Eppendorf 筐，其中为持检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
8.1. 2. 2每管加人 100 μl,DNA 提取液 1+然后分别加人待溅样本,阴性对照和阳性对照各 100 μL，一份样本换用一个吸头，混匀器上毫满混句5s，于4℃～~25℃条件下，130001/min离心10min。8. 1. 2. 3 尽可能吸弃上清且不碰沉淀,再加入 10 μL DNA 提取液 2,混勾器上囊荡混勾 5 s。于 4 ℃C25℃条件F，20001/min离心10s。8.1.2.4100C干浴或沸水浴10min加入40±l无DNA醇的灭菌纯化水，13000r/min离心10min上清即为提敢的DNA，脉上保存备用。8. 1. 3DNA 提取后的处理要求
提取的 DNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增或放置于一7心 C冰箱。8. 2扩增试剂准备与配制
在反应混合物配制区进行。
从试剂盒中取出猎链球剪2型荧光PCR反应，Ta4酶，在室温下融化后，2000r/min离心55。设所需PCR数为n，其中n为待检样品数一管阳性对照及一管阴性对之和。每个测试反应体系需便用15μLPCR反应及0.3μLTag酶。计算各试润的使用量，珂一适当体租试管中向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。8,3加样
在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加人8.1.1.7或者8.1.2.4中制备的DNA溶液10μL，使总体积达25μL。盖紧管盖后，500r/min离心30s。8. 4荧光 PCR 反应
在检测区进行。将8,3中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置：
一第阶段，须变性92℃3min
——第二阶段，92℃5s，60℃C30$，45个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。
9结果判定
9.1结果分析条件设定
读取检测结果。阅值设定原则以阅值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最商点，不间仪器可根据设器噪音情况避行调整。
9.2质控标准
守.2.1阴生对照无Ct值并且无扩增曲线。9.2.2阳性对照的Ct值应≤30.0.并出现特定的扩增曲线。9.2.3：如阴性对照和阳性条不满足以上条件，此次实验规为无效。GB/T19915.7—2005
3结巢描述及判定
9.3.1朋性
无C值并且无扩增曲线，表明样品中无猪链球菌2型。9.3.2阳性
Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪链球菌2型附录A
(规范性附录）
碘酸盐缓冲生理盐水配方
A, 1A 液(0, 2 mal/L 磷酸二氢钠水溶液)GB/T 19935.7-—2005
-水合磷酸二氧钠(NaH,PO。*H,0)27.6 g,溶于蒸馏水中,最后稀释至 1 000 mLA.2B液(0.2 耐ol/L磷酸氧二钠水溶液)七水合磷酸氢二钠（NaHPO,·7H.O)53.6多，或十二水合磷酸氢二钠（NazHPO,：12H.0）71.6g或二水合磷酸氢二钠(NazHPO,-2HO)35.6g加蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL-。A,30. 01 moI/L、pH7. 2磷酸楚缓冲生理盐水的配制0.2mol/LA藏
0.2mol/LB液
氯化钠
用蒸馏水稀释至100mL。
GB/T 19915. 7--2005
附录B
（料性附录）
猪髓球菌 2 型获光 PCR试剂盒组避、说明疫使用时的注意事项B, 1试剂盒的组成
试剂盒的组成见表B.1。
殖链球首 2 型费光 PCR 试剂愈组成姐皮 (48 tests/盒）
囊解衰(糖取方法 1)或 DNA提取液 1(提取方法 2),DNA4台 mLX 1 盒(裂解液)或 mLX 1 管(DNA 提取液 1),提取液2(接取方法2)
猪链球 2 型荧光 PCR ,反应液
Tan酶(5U/μI.)
无 DNA 酶的灭菌纯化水
阴性对照bzxZ.net
阳性对照
1. 6 mLX×1替(DNA提取液2)
750 μl,×1 管
15 μL×1管
1mL×1管
1mLxI管
1 mL×1管
裂解液为 DNA 提取试剂,外观为我绿色;DNA 提取液 1,2 为无色液体，一20℃C保存。B21
B. 2. 2无 DNA 酶的灭菌纯化水,用于溶解提取的 DNA。B.2.3PCR反应液中含有特异性引物、操针及各种离子。B, 3使用时的注意募项
B,3.1由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交及污染B.3.2反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管否盖紧.以免荧光物质泄漏污染仪器。
8,3.3除裂解液外，其他试剂一20 ℃保存,有效期为 6 个月
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