【商检行业标准(SN)】 玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1375-2004
玉米细菌性枯菱病菌检疫鉴定方法Methods for qunrantine and ldentification ofPantoeastewarfit (Smith?Mergaert etal2004-06-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检获总属bZxz.net
2004-12-01实施
SN/T 1375—2004
玉求细茵烂忙美病(Sccwerc'sBacter:al wiltof Com)足主米上的种毁灭件的病开，我用尚尤该病者发生，该病以通过带种于避距离作据（种），在病区则以昆史传插为。其病原菌PnteJtewartiz（Sith）Meigasrtetal.异名：Eruiniasteuarrii（Smith）Dye，fi文名你，斯泛苗，生12年农业部频布的毕人见共和层逆统情物检核危险性病虫，杂草名录3中，鼓列为一类危险性有生物，为侵护垂国表业生产，防止玉来细菌性枯获病传人我，做好选境植物检疫工忙，规范开让.响革据该病索的检效鉴定方法·特制定本标满，1范围
玉米细菌性枯藝病菌检鉴定方漆本标痛规定了逆境祯物检疫中下米细末性粘离病菌的检疫和浆定方法，本标准适代于进意种用及其他用盗玉米宁玉米细性枯美病谢的检按相鉴定，2规范性引用文件
SN/T1376—2004
下列文件中的条款适过本标准的引用需战为本标推的签款，孔是注且期的引用文件，英随后所有的懂改申（不包乾读的内穿战修订腋沟不适用于本标痒，然而·炫两权车标准达我协议的名方研究咨可使这当文件的品新版本，凡是不注口期的引用文仆，其战新版本适用于本标准、SB：T4780.38—194品1生数尘物学检冷染色法，培养基熟试烈3原理
3.1米细临性枯病前的分类地位
玉本细菌右菱病菌Puntesterrt（Sri:nMerguerrctel异名，Eruiniaeirtt（Smith）Lye.#原段生物总rocaryotae姚朗界Bacterium，两惠门Gracilic.nes科Entenhaetericrc泛弹Pamton。为莱生氧杆的，年长网性，大小为c.m--D.7um乘0.n~2.0m无短毛，两瑞回，单生成以短链形式存在。设病消长正求上引发的玉来潮离性技变病是一种典型的维管病害，些病害为种传，错菌新！是其远距两传蛋的主要双致，3.2检应原理
醇联免疫吸雌试验(ELISA)及免疫及附分离试验利雕盘消学技术兵有特元性强的优点，与常规生生化定技术协庭用下金采种了中F71的检谢分声利整定.真有决运，流敏、有效型结乐准独的特点·范合对米冲子审产.ter的度鉴定。电仪露、设备
小型龄碎机，超E作台、火平、博温培养箱.高压灭脑锅、生退酸镜、避标仪、钱板器、酸度让、高来冷床高毛机，可调修效器来乙深塑料培荐等.5药品，试剂、培养基
检中际需药药品沟为分新统。
5.1药品
读配就（NaC炭酸销（NAIECO、能酸钱纳（VIP、，12FT）解装盒邮(K,P,),敏化纳（NaCl)、化钾（KCI、化等（aCl,），温-20（Twrcen-20）,避醛型第（KHHU,）送（MuSO，、H），双氧水（HU）叫P基峡架胺，二苏业砜，蛋白陈、蓝讲C：H扰坏定胶CT,爱酶标记连白HRP-SPA升()或氯酸效[NaCI,师(CHCHOH)等.
5.2试剂
苹兰氏然色粮、鞭·吾染色燕。5.3培养基
改息W泛培养基，制作方法见附录A。1
SN/T 1375—20C4
6对用葱恢和抗血清
明、阳性对照的，其明性对照菌可选用除P，e以外的、不同种细营置殊，一段为尚量不同种的菌；单兰氏染色中的阴性对服暂为大断样当（正scheriehrcatt)，对服菌在应用中需配制成10cnL法度的悬技，
检验巾所需抗体均为司种卫.srerrti抗血消，其征用率度依其效价而定。2玉米细菌性枯整病菌sterti的检测,分离受策定7.1检验样品的制
从待检样战中挑选不成熟的、装端的、有变轴的及色疫深的籽粒书为检验推品。每份检验品应个少于0.25kg。待检样品在0.2=kg以上.1kg以下的、检验错高可适当减少，但不得低于0.125kg。7.2样品的检验
7.2.1检测母液的制备
7.2.1.1拌品表面消离
将检验样品用n.1开汞【EgCl)落液进行表消毒处理1-in--?in.或月3%~5%的次靠酸钠（NaOCl)表弹消寿处理Fmin15mi-1,热后无菌水冲洗三饮，无疏条件下晾T。对三药剂拌种的种子样品，可用乙尊CH，CHOH)洗去表面药剂后，再用无水冲洗三次，无菌条件下惊下。7.2.1.2悬的制备
将表面消率后的检验品粉萨跑到三角瓶加适量0.5%生理盐水产温浸泡4h~6h或量4之冷做箱中过夜。之后将种子设范液移人离心管，在1o01/min下离心15mic,弃去沉旋，敢上清缺转人见外离心告，100rmin离心15nia弃志上法液，邮2m生理扑水使之悬率，得到盘夜。将起液分成两份，份0.：nt.用于HI.ISA於测，刃外送1.5ml.释10倍用端免疫分离、7.2.2应用SPA-ELISA检刷P,stewarr7.2.2.1包费
在联税拔孔内每孔剂人2101.以他被凝冲液严释的SP.保湿条件下于4落靠箱中过皮。7.2.2.2洗涤
用2ST洗够游洗速三次，每次时间为min7.2.2.3加第一抗体
问做孔中加烂20C.经矫释的第一抗体架逐条下叠干37培箱中孵2h7.2.2.4洗涤
法见7.2.2.2.
7.2.2.5加检悬液
间搬孔中加注检试悬液每孔产！..同时没朗、阳性及空白对照（空白对照用上理盐水）保湿苯下管了37'C.培养箱中第弃3E。
7.2.2.6洗涤
方法见, 7, 4. 2. 2。
7.2.2.7加第二抗体
向我孔中加2CC.纤稀释均第二长休，保派来件下置干37养箱中料育2b7.2.2.B洗涤
方达见 7, 2. 2. 2。
7.2.2.9加酶标记A蛋白
向极孔中加2GC经稀群的酶标记A蛋白，保谨条丹下蓝于37℃培落箱中孵育2上。7.2.2、10选
方法见7.2.2.2.
7.2.2.11加鹿物反应液
SN/T1375—20D4
向板孔中生1C0JL物反应，黑略杀件下反应20mitl左右，真至阳性对照孔显出明品的爆色，
7.2.2.12终止反应
板于中加注100A1.2arl/1.硫腰述止朝免反应：7.2.2. 13读收
在薛标仪上以490am波长测定各至的U>值.资数前以空白孔调整为0。7.2.2.14SPA-E1.ISA结果判定
将详品孔和引性对照孔的读数进行比校，如果样品孔与明性孔的OY比值大于则检测结采判定为阳生，拌品中可能带有玉米细消性枯要病菌,trwzrti害进行下一步7.3病断的分离和鉴定工作1咨列，判定最终检测结果为房性，样品中不有主来细菌性枯类病P.steuu法，7.3瘤雷的分两和鉴定
7.3.1病菌的免疫分商
7.3.1.1抗血清包被
在聚苯乙培培苯正底部反面用记号笔刻出五个轻为1.5m的圆形区城作为标卒区减，然后再在培并血中的每个标木区域内，加以包鼓缓冲液程骚的三来组菌性枯萎病菌扩止将300L，涂满龄个区城。倍非加盖儿于湿盒内，%7C孵弃3--4或在4冰箱中过丧，7.3.1.2洗涤
出洁养Ⅲ，用KT液冲洗五次，之后在培养血内加RTP链强益整个培养血的底部，37它恒温辖中孵分 h.
7.3.1.3如菌悬
除去RTF被,问培求血中加7.2.1.2制备的悬被愁波应题益整个培养血的底部，培养血加益儿置于金内，在37温箱中孵育：h或在1冰箱中过夜，同时设网、附检及空白对服（空白对眼用生理盐求
7.3.1.4洗涤
取山养m.用RT液冲洗五饮，期闻间恶受泡2 min.7.3,1.5倒培荞基
院去残留的RT滤，向培养血中人℃.5心的收实双长培养基，能够更英整个培养血的底邮邸可。
7.3.1,6病菌的培养
拍培养放人3心亡恒温粮中培养、定对观察菌落的户现情况。从中挑取读丧色或黄色的，利隆起，油质状，边漆整齐、生长迅速，半造叫且有较大帖性的淋转接率见外改良W氏培葬基平按上，30垢获，战然获得具有上还特征的，事一畜落形态的分离菌，7.3.2分离的鉴定
7.3.2.1羊兰氏染色
按6F/47R3.28—1594中2.3规定前方法进行。如其梁色结来为苹兰去朗性菌.质继续进行下一步7.3.2.2颜毛染色亡炸如右炎色结果为革兰阳性菌，则判定最然鉴定结果为检验样品中不带有下米细菌性枯萎病菌.seu。7.3.2.2粮毛染色
按GB/T4799.28—1SS4412.7规定的方法进行。如某分高菌经镜检发现光毛，买继续进行下一如7.3.2.3分离菌的生理生化测定工作+划若发现3
SN/T 13752004
有愧毛，测判定敏终鉴定结果为格验样品中不书有米编菌生估类病萄P，tTE?7.3.2.3生理生化副定
玉米细曲性括差病菌Pazuerrar的生生化特证见附录B如分离菌药生理生化测定精果与Panoeer的生理生化持征柜符合，可据此州定最终鉴定结总为，该分离菌为P.exartt,样品中带有天米纪菌性粘离病菌Psteuarti妇不存，贴灯定取姿鉴结果为阴性，样品牛不带有玉来细酋性粘装病菌P，7.4结果评产
如果7.2.2.14检测结果为阳性，4在7,3.2中各项鉴定结果均为阳性，判定是终检疫鉴定结果为旧性，样品中带有玉文细菌括病P.steuarti:也则判定最终疫整定结来为阴，Y品中不带有下米细商性粘获病菌P.steart.8样品和酋抹的保存
长存样品应不少于1kg。船运款装玉米样品的架存适按总别、层次，品种，等敬分别存放；种并下兴样品的保存获泄号或品种分别在放：保存样品经登记和经手人签宇后置于低温十燥，防实防氟处安苗保存个月。发规主米测苗性芯考病的的拦品少要保存六个月，已备尽验、说类和仲裁。保存期满后，写经灭的处理.
分离并鉴定关来细南性估营病函，i的声应软松对试管积面上，经登：和统于人塞字后置于4%左右低温冰粘中保存，定期（S0d--60d)转接，以质止族菌死亡必要时泌下后长期保存。4
A.1试剂
A.1.1: EL[SA
附录A
（规范性附录）
别及培养基的配制方法
A.1.1.1包被缓冲准（0.05m1ol/碳酵热缓冲液p9.6）SN/T 1375-2004
破醛钠N(),.39x碳酸至钠NaHCO)2.53g骨氢化钠（NaN>028加左菌水落邮后.品终定容至1r.,
A. 1. :.20.1mol/LpIT7.4FS磷酵睡冲液胖单%KHP>0,2R峰晚二(NaHFO,12H）2.9g要化钠NaC）8氯化钾（KC1)3.2，无函木落就后·取资定穿会1000mL，.1.1.3PBST洗涤液
5.1xo.p.4P糖酸冲液u湿.2n至.%。A.1.1.4底物缓冲液
A(U1mo1/柠檬单落液柠楼单12木加火菌水解后录终定穿全100C，装（0.2m1.NHP溶液磷酸款=钠(NHPO,-12H)71.6加灭水落解量终定奔率 1 000 r1.,
取A服2.22=B效2.7L泥合雨加幽水单：0m得划亲物经冲离。A.1.1. 5底物反应液
TMB四基联举胶比中亚融死成1umg/mT)1Ce1.加%双氧水1Cl.混合后底物级荷液丝.01
A.1.1.6A黄白(SPA)
以包披强冲液稀挥（效考产品快用说明）.A,1.1.7酶标EA白(IRP-SPA)
以PBST积弃<税择培数泰老产品位用说明）4.1.2表面消毒液
升*HC)1多依盐(HC2.5L水100mL：光将升乘路一盐酸中然后加水稀释，A,1,3免疫分间
A. 1.3. 1 RT 严
化销（>)2g氯化KC0.C5·需化钙（CaC0.05.碳酸氢钠XaHC>0.25磷酸KPU22Te201.100EH7.
A.1.3.2RTP液
RT液加%蛋白流
A2改良W氏培葬基
链（C:HO.>10K.蛋白6K磷酸氢二（K.HP)0.5g统镁SN/T 1375-2004
附景B
(规范性附录)
Pandet&rewartti的生理生化特征玉米细菌性枯萎病菌在虏胶土生长骚慢，不液化明胶除驱币怀外不还原硝敏盐1不产生化氢，面产生可噪很少或不产生：在石恋步钙中轻谢产酸和脱色不题乳利脉化从菌萄赫、半乳钟.避糖，只轴，阿拉伯格、木错、乳忧、七驱糖，廿份醇和廿油产但不产；从壶牙特，良李糖和半乳糖不产酸利气。在性灭氧条件下生长时，由菌能抽，乳够利蕊拥产践不产气，氧化肌醇产载，不能利用水杨书：水辉瓷粉阴性、无解赠能力：酮型5%--7%的氧化钠；在C.3%牛期酸存车的案性下生长良好，
Pansoeusewar（syr：Eniniexrr)与改文氏菌属宁各种间生理生化反应区别见表B,1。表 B.1Panloea stewarti与效文氏菌障(Erwinia)中各种间的生理生化反应的区别通
醒化氢产生
轩维二接
叫案试验
硝腰盐还序
栋一悔
安节情
L-利拉伯挠
甲然能的
内二映盐
监内河晚股
网东燃醇
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