【农业行业标准(NY)】 巴氏杀菌乳和灭菌乳中复原乳的鉴定

ICS 67.050
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 939-2005
巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中
复原乳的鉴定
Identification of reconstituted milk in pasteurized and UHT milk2005-09-30发布
2005-09-30实施
中华人民共和国农业部
本标准的第4章为强制性条文，其余为推荐性条文。本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准出中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院畜牧研究所。NY/T939—2005
本标准主要起草人：王加启、下登攀、魏宏阳、李树聪、丁建国、郭宗辉、付宝华、周凌云、刘世军、黄萌荫、刘光磊。
1范围
巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定本标谁规定了巴氏杀菌乳和UHT火菌乳中复原乳的鉴定和相应的检测力法。本标准适用于巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定。2规范性引用文件
NY/T 939—2005
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版木。儿是不注日期的引用义件，其最新版本适用于本标准。GB/T5413.1，婴幼儿配方食品利乳粉蛋白质的测定GB/T 6682—1992分析实验室用水规格和试验方法ISO5538：1987乳和乳制品样品质检验3术语和定义
下列术语和定义适用丁本标推，3.1
生乳 raw milk
从健康奶畜挤下的常乳，仅经过冷却，可能经过过滤，但术经过巴氏杀菌、低于巴氏杀菌的热处理、净乳和其他的杀菌处理。
复原乳 reconstitated milk
炼乳或/和全脂乳粉与水勾兑成的原料乳。3.3
巴氏杀菌 pasteurilization
经低温长时间（62℃～65，保持30min）或经高温短时间（72它～76℃，保持15s；或80～85℃，保持10s～15）的处理方式。3.4
超高温瞬时灭菌UHT
经135亡以上保持数秒的处理方式。生乳经 UHT灭菌处理后，乳果糖含量应该低于 600 mg/L心4复原乳的鉴定
4.1巴氏杀菌乳
当巴氏杀菊乳每100g蛋白质中氨酸含量大于12mg时，则鉴定为含有复原乳。4.2UHT 灭菌乳
当UHI灭菌乳发生下列情况之一时，则鉴定为含有复原乳：a)W-0.7×t>190;
式中：
NY/T 939 --2005
-待测UIIT灭菌乳样品中每100g蛋白质中糠氨的含量，单位为毫克（mg）；t待测UHT火菌乳贮存时间，单位为天（d)；0.7-
-待测UHT灭菌乳每贮存一天每100g蛋白质中产生的氨酸量，单位为克（rIg），b）当UHT灭菌结束时乳每100蛋白质中概氢酸含量为140mg~190mg时，乳果糖含量（g/）与糠氨酸含量（每100g蛋白质所含毫克数）比值小于2，5试验方法
5.1糠氨酸含蛋的测定
5.1.1原理
牛奶在加热过程会发生梅拉德反，使强白质和糖生成特定产物之糠氨酸（=-N-2-峡喃
甲基-L-赖氨酸）。瓣氨酸的含量利用高效液机色谱紫外（280rrn）检测器测定，依据氨酸标准物质定量。
5.1.2试剂与材料
除非另有说明，在分析中仅而分析纯试剂和GB/T6682-·1992中一级水。5.1.2.1中醇（CH,OH)：色谱纯，用0.45um滤膜真空脱气过滤。5.1.2.2高纯度氮气：99.99%。
5.1.2.33mol/L盐酸溶液。
5.1.2.410.6rol/盐酸溶液
5.1.2.5兰氟乙酸（色谱纯）溶渡：体积分数为0.1%。5.1.2.6糠氨酸（furusine）（e-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸）标准购备溶液：将糖氮酸标准物用3mol/L盐酸溶液（5.1.2.3）配制成200/mL的标准贮备液，该标准贮备溶液在一20C可贮存24个月。5.1.2.7糠氨酸标准工作溶液：取0.1mL标准贮备落液（5.1.2.6），用3mol/盐酸溶液（5.1.2.3）定容至10mL，配制成2号/mL的糠氨酸标准工作溶液。5.1.3仪器和设备
5.1.3.1检测实验室常仪器设备。5.1.3.2高效液相色谱仪，带有梯度系统，UV-检测器。5.1.3.3凯氏定氮仪。
5.1.3.4C18萃取柱，500mg。
5.1.3.5佳胶色谱柱：颗粒大小5mm，柱道径4.6trum，长250mm=5.1.3.6干燥箱：110℃=2℃。
5.1.3.7带螺盖耐热试管或者其他能够密封的耐热试管：容积为20mL5.1.3.8注射器：10mLc
5.1.4采样
取代表样2501n送往实验室，样品不应受到破坏或者在转运和贮藏期间发牛变化。采样参照ISO 5538：1987执行
5.1.5分析步骤
5.1.5.1试样水解液的制备
吸取2.00mL试样，置于带密闭的耐热试管（5.1.3.7）中，加入6mL的10.6mol/L盐酸溶液（5.1.2.4），混匀。向试管中缓慢通人高纯度氮气（5.1.2.2）1min~2min，密闭试管，然后将其置于干燥箱（5.1.3.6）中，在110心下加热水解23h-24h。加热约1h后，轻轻摇动试管。加热结束后，将试管从干燥箱中取出，冷却后干过滤，保留滤液供测定。2
5.1.5.2试样水解液中蛋自质含量的测定NY/T939—2005
吸取2.00mL试样水解液（5.1.5.1），按GB/T5413.1测定试样济液中蛋质含量。5.1.5.3试样水解液中糖氨酸含量的测定5.1.5.3.1试样水解液的纯化
将C18萃取柱（5.1.3.4）安装在注射器上，先后分别用5mL甲醇和10mL水润湿萃取柱，保特萃敢柱湿润状态，吸取0.500ml.试样水解液于萃取柱，用注射器（5.1.3.8）缓慢推入C18萃取柱内：吸取3Inol/L盐酸溶液洗脱萃取柱巾的样品至3ml5.1.5.3.2测定
a）色谱条件：C18硅胶色谱柱，250rmm×4.6mm，5um粒径，柱温32℃。b）洗脱液：0.1%三氟乙酸溶液（5.1.2.5）为洗脱液A，甲醇（5.1.2.1）为洗脱液B。c）洗脱梯度：见表1。
表 1 洗脱梯度
洗脱液A
洗脱液B
d）.测定：利用洗脱液A和洗脱液B的混合液（50:50），以1mL/min的流速平衡色谱系统，注入20uL～50,L的3mol/L盐酸溶液平衡柱子，以检测济剂的纯度。注入10μuL待测溶液测定糠氨酸含量。每测定10个样品后测定一次标准工作溶液（5.1.2.7），以校准仪器。糠氨酸的出峰时间应该在 8 min ～10 iriti (参见附录 A和附录 B)。5.1.6结果计算
糠氢酸含量以样品质量分数W计，数值以每100蛋白质中所含毫克数表示，按如下公式计算：W=6xD×100
式中：
样品中每100g蛋白质中糠氨酸的含量，单位为毫克（mg);样品水解液中糠氨酸浓度，单位为微克每毫升（g/ml.)：-测定时稀释倍数（D=6)；
-样品水解液中蛋白质浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）。计算结果精确到小数点后-一位。5.1.7精密度
在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。5.2乳果糖含量的测定
5.2.1原理
牛奶在加热处理过程中，部分乳糖异构为乳果糖，经βB-D-半乳糖苷酶水解后生成半乳糖和果糖，通过酶法测定产生的果糖量计算牛乳中乳果糖含量，5.2.2试剂与材料
除非另有说明，在分析中仪用分析纯试剂和GB/T6682一1992中一级水5.2.2.1碳酸氢钠（NaHCO）
NY/T 939—2005
5.2.2.2过氧化氢（H,02)，质量分数为30%5.2.2.3辛醇(CH0)
5.2.2.4灭菌水
5.2.2.5300g/硫酸锌溶液
5.2.2.6150g/L亚铁氰化钾溶液
5.2.2.70.33mol/L氢氧化钠溶液（NaOH）5.2.2.81mol/L氢氧化钠溶液（NaOH）5.2.2.9缓冲液A：=7.5
称4.8g磷酸氢二钠（Na2HIPO4），0.86g磷酸-~氢钠（NaH,PO4·H,O）和0.1g硫酸镁(MgSO47H0)溶解十80ml.水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH到7.5±0.1（20C），稀释到100 ml，摇勾。
5.2.2.10缓冲液B:pH=7.6
称取14.00g三乙醇胺_N（CHCH,OH),HCI」和0.25g硫酸镁（MgSO4.7HO）溶解于80rrL水中。月1Inol/氢氧化钠溶液（5.2.2.8）调整pII到7.6±0.1（20℃），稀释到100mL，摇匀：5.2.2.11缓冲液C
将40.0mL缓冲液B用水稀释到100m止，摇勾，5.2.2.12B-T-半乳糖苷酶悬浮液用3.2mal/L硫酸铵溶液将活性为30IC/mg的3-L-半乳糖并酶（FC.3.2.1.23）制备成浓度为5mg/mL的感浮液
5.2.2.13葡萄糖氧化酶悬浮液
用灭菌水将活性为200IUJ/mg的葡萄糖氧化酶（EC.1.1.3.4）制备成浓度为20m/mL悬浮游液。
5.2.2.14过氧化氢酶悬浮液
用火菌水将活性为65000IL/m的过氧化氧酶（EC.1.11.1.6）制备成浓度为20mg/mL的态浮液。
5.2.2.15己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液在1mL浓度为3.2mol/L硫酸铵溶液中加人2mg活性为140IU/mg的已糖激酶（EC.2.7.1.1）和1m活性为140IU/ng的葡萄糖-6-磷酸脱氮酶（EC.1.11.1.6)，轻摇均匀，成悬浮液。5.2.2.16磷酸葡萄糖异构酶悬浮液用3.2ml/L硫酸铵溶液将活性为350IU/mg的磷酸葡萄糖异构酶（FEC。5.3.1.9）制备成浓度为2mg/mL的想浮液。
5.2.2.17ATP溶液
将50mg5-ATP-Na2和50 mg碳酸氢钠（5.2.2.1）溶于1mL水中：5.2.2.18NADP溶液
将 10 mg βB-NADP-Na2溶于 1 mL水中。5.2.3仪器和设备
5.2.3.1检测实验室常用仪器设备：5.2.3.2水浴或千燥箱：温度能维持在40C+2℃5.2.3.3分光光度计，能在340rrn波长处检测。5.2.4采样
同5.1.4。
5.2.5分析步骤
5.2.5.1试液制备
量取50.0mL样品到100mL容量瓶中，用水稀释到刻度后混勾，5.2.5.2纯化
NY/T 939—2005
吸取10.0mL试液（5.2.5.1）于50mL锥形瓶中，依次加人1.75mL亚铁氰化钾溶液（5.2.2.6）、1.75mL硫酸锌溶液（5.2.2.5）和6.5mL缓冲液A（5.2.2.9）。每人一种溶液后，充分振荡均勾。全部溶液加完后，静置10min，过滤，弃尽最初的1ml.--2mL滤液，收集滤液。5.2.5.3水解乳糖和乳果糖
吸取5.00m滤液于10rL容量瓶中，加人50的β-D半乳糖酶悬浮液（5.2.2.12），混匀后加盖。在40℃水浴或T燥箱培养至少10h5.2.5.4葡萄糖氧化
依钦加人2.0mL缓冲液C（5.2.2.11）、100μL葡菊糖氧化酶悬浮液（5.2.2.13）、1满辛醇（5.2.2.3)、0.5mL浓度为0.33mol/L氧氧化钠溶液（5.2.2.7）、50L过氧化氧（5.2.2.2）和0.1mL过氧化氢酶悬浮液（5.2.2.14），每加人一种试剂均要摇勾。全部溶液加完后，在40C水浴或十燥箱中培养3h。冷却后稀释至10mL，过滤，弃去最初的1ml～2mJ.滤液，收集滤液。5.2.5.5空白
依照5.2.5.1到5.2.5.4步骤处理空自济液，不加B-I）半乳糖并酶悬浮液（5.2.2.12）。5.2.5.6测定
测定步骤见表2，
表 2测定步骤
比色血中依次加人：
缓冲液 R (5.2.2.10)
ATP溶液(5.2.2.17)
NADF 潜液 (5.2.2.18)
滤液(5.2.5.4）
混合均句后，静置3tmin
加人己糖激酶/葡萄糖-6-鳞较脱氢悔悬浮液（5.2.2.15）混合均匀，等反应停止后（约10 min）、记录吸光值加人磷酸葡萄糖异构酶浮液（5.2.2.16）混合均匀，等反成停正后（10 min-15 min)，记录吸光空
注1：以上反应均在向一比色且中完成注2：如果1mL滤液吸光值增加超过1.3，则减少样品滤波取样体积，注意增加水以保证比色皿中反应液总体积不变
5.2.6结果计算下载标准就来标准下载网
5.2.6.1吸光值差
样品吸光值差AA.的计算：
AA,- (A-A)
空白吸光值差AA的计算：
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样品净吸光值差AAL的计算：
5.2.6.2乳果糖含量
A= (A-A)
AAL=△A,-AAh
乳果糖的含量以样品的质量浓度c计，数值以毫克每升（mg/）表示，按下列公式计算：ML× V, ×400
exuxVx×ML
式中：
AAL…-样品净吸光值差；
-乳果糖的摩尔质量（342.3g/mol）；NADPFT在340nm处的摩尔吸光值（6.3Lmmol:1.cm1)；比色.Ⅲ液体总体积！，V=3.240mL；比色血中滤液的体积，V2-1.00 mL;比色血光路长度，d=1.00cm；
测试样体积（L)。
计算结果精确到小数点后一位。5.2.7精密度
在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%6
附录A
(资料性附录）
糖氨酸标准物的分离图谱
蜂1-8.816
NY/T 939—2005
13.0014.016.0018.0020.00
注：横轴表示保蜜时间，单位为分钟（min)：织铂表示吸光度（AL)；峰1袁示糖氨酸峰。NY/T939—2005
附录B
(资料性附录）
巴氏杀菌乳样品中糖氨酸的分离图谱umw
2.004.006.0m8.00
10.0012.0014:0016.0018.0020.00径：横轴表示保留时问，单位为分钟（min），纵轴表示吸光度（AU)；峰1表示赖氮酸峰。8
22.0024.00
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