【商检行业标准(SN)】 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1204—2003
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
Protocol of the real-time PCR for detecting geneticallymodified plants and their derived products2003-03-17 发布
中华人民共和国
国家属是督检验检楚总属
2003-09-01实施
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1204—2003
本标准由中华人民共和国质量监督检验检疫总局动植物检疫实验所、中华人民共和国广东出入境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫负贯起草本标准主要起草人·朱水芳、草文，曾际娟，章桂明、潘良文、黄文胜、陈红运。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。1
1范围
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
本标准规定了植物及其加工产品中转基因成分的实时荧光PCR定性检验方法，SN/T 1204—2003
本标准适用于玉米,大豆、油菜籽、马铃薯、番苯、棉花、烟草及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验或者其他检验方法检测结果为阳性的确证实验。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的能改单（不包括谢误的内容)或能订版均不适用于本标难，然而，鼓励根据本标推达成协议的各方研充是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求SN/T1194植物及其产品中转基因成分检测抽样和制样方法3缩略语
下残缩略语适用于本标准。
3. 1 AmpErase UNG rurecil N-glycosylase.3.2C.值；C:cycle,t,threshold，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，3.3IPC.internalposjtivecontrol,内多照。3.4NTC.notemplatecontrol,空白对照，3.5PCR:polymerase chain rection.简称 PCR。3. 6DNA;deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。3. 7 dNTP,deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸。3. 8dATP:deoxyadenosine triphosphate,脱氨腺苷三磷酸3. 9 dCTP deoxycytidine triphoaphate,脱氧胞苷三磷酸,dGP,deoxyguanosine triphosphate,脱氧鸟苷三磷酸。3.10
dUTP,deoxyuridine triphosphate,脱氧尿苷三磷酸,3.11
bp,base pair,碱基对,
Tag酶：DNA案合醇
Tris;tris(hydroxymethyi) aminomethane，三(羟甲基)氢基甲烷TE,Tris-CI,EDTA缓冲液.
Lcctin:植物受集素,
ZEIN:植物醇溶蛋白.
PE3-PEPcasetphosphoenilpyruvate-carboxylase,磷酸烯醇式丙酮酸效化酶。tRNALeu;植物叶绿体基因。
SN/T 1204—2003
3. 2018s rRNA,真核生物 18 s 核糖体 RNA 基因。3.21CaMV 35S:35S promoter from cauliflawer mosaic virus,来自于花椰菜花叶病毒的 35S启动子。3. 22 NOS:terminator of nopaline synthase gene,胭脂碱合成酶基因终止子。3. 23 FMV35S,35S promoter from modified figwort mosaic virus(eaulimovirus group),玄参花叶病毒 35S启动子。
3.24NPTII,neamycin-3'-phosphotrangferase gene,新霉素-3'-磷酸转移酶基因.3.25BAR:phosphinothricin acetyltransferase gene from Bacillus amyloliquefaciens,来源于杆菌Baciltus amytoliquefaciens草了膦乙酰转移酶基因。3. 26 PAT:phosphinothricin acetyltransferase gene,草丁膦乙酰转移酶基因3.27GOX:glyphosate oxidareductase gene,草甘膦氧化还原醇基因。3. 28 CrylA(b); α synthetic gene encodes the first 648 amino acids, insecticidal-active ftruncatedproduct identical to that of cryIA(b) gene of Bacillus thuringiensis subsp,苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 IA()基因,
3. 29 Cry3A:B. thuringiensis subsp,Tenebrianis(H. t. t. ） strain BI 256-82 抗虫毒蛋白,选择性毒茶科罗拉多马铃尊甲虫(Colorado potato beetle larvae)。3.30EPSPS:5-enolpyruvylghikimate-3-phosphatesynthasegene,5-苯草酸-3-磷酸合成酶基因。4防污染措施
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光 PCR 定性检验过程的防污染措施应符合 SN/T 1193 的规定。
5 抽样与制样
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验按照SN/T1194规定的方法执行。6实验方法
6. 1原理
实时荧光定量 PCR 技术,是指在 PCR 反应体系中加人荧光基,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一赛核昔酸，两分别标记一个报告荧光基团和一个萃灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被渐灭基团吸收，PCR扩增时，Tag酶的5'嫩-3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和萍灭荧光基团分离，从而荧光监劑系统可接收到荧光信号，即每扩增-~条 IDNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。6. 2主要仪器
6.2.1实时荧光定量 PCR仪。
超净工作台。
消毒灭菌锅。
制冰机。
核酸蛋白分析仪。
高速冷冻离心机，台式小型离心机,Mini个人离心机。低温冰箱，冷藏玲冻冰箱。
纯水器,双蒸水器。
蓝涡腰药器，
6.2.10微量进样器，0.5μ、210、20μ、100μ、200、1000μ6.2. 11光化学 PCR反应管
6. 3 主要试剂
除另有规定外，所有试剂均果用分析纯或生化试剂，6.3.1
实验用水应符合 GB/T 6682中一级水的规格。PCR 缓冲液。
氧化镁(MgCl,),
dNTPsdATP、dUTP、dCTP.dGTP).UNG 酶(Uracil N-glycosylese).Tag 酶.
引物和揉针
SN/T 1204—2003
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR检测所用引物和操针序列见表1,囊1实时荧光PCR实验所用引物和探虾序列检测基因
Lectin
PE3-PEPease
tRNALeu
18 erRNA
CaMV35S
FMV35S
引物序列
5'-tgnacccatgcatgcagt-3\
5'-gkcaagaccattggtga-3\
5'-cctcctcg3gaaagttacab-3'
5'-gggcataga+grtg++gtt-3'
5'-ccagttettggagccgcttga-3
5'-aagggccagtccaatgcage-3
5'-cgaaatcggtegacgctacg-3\
5'-1tccattgaglctelgcerct-3
5'cctgagaacggctaccat3\
5'-cgtgtcaggattgggtaat-3
5'-cgacagtggtccanga-3\
5'-aagacgtggttggaacgtcitc-3'5'-atcgttcanacalttggca-3\
5'-nttgcgggactctaatcate.3
5'-sagacatccaccgeagactta-3
5'-aggacagctettitccacgit-3'
5'-aggatccgtcgtg+cccat-3\
5'-gcacgiggaagcggtce-3'
5'-acaagcacggtenncttcc-3\
5'-nctcgccgtecagicgta-3'
5'-gtcgaca1gtctccggagag-3
5'-gcaccaaccaegggtate-3
5*-gtcttcgtgttgctggaaccgtt-35'-gaactggcaggagcgagagct-3\探针序列
5'-tggcgtgtecgtcctgatgc-3\
5'-ccetcgtctertggtcgcgccctct-3\5'-caggtcgctatgcgactgcggagace-3\5'-gchatccigngccnaa tcc-3\
5'-tgcgcgcetgetgccttcct-3\
5'-tggacccacccgaggagcsi-3'bzxz.net
5'-catcgcaagaccgcaacagg-3\
5-tggtccececaagccagctgctcga-3'5'-cacccagccgccacagtcgat-3\5'-ccgagccgcagguuccgceggag-3\5'-tggcgcggttgtgatatcgtta-3's'-tgctcacgttctctacartegcgcteg-3\适用范菌
玉米及其加工产品
（内源基因）
大豆及其加工产品
(内潮基因)
油菜籽及其加工产品
(内摄基因)
(内参随基因)
真核生物
内参基因》
转基因大豆、玉米、油莱籽、
普布,马性薯及其加工产品
特基因大豆，玉米，油莱籽，
著药、耳峰及其加工产品
转基因油菜野、马龄著、著
茹和棉花（籽)及其加工
转基因油籽、香茹、马龄
善及其加工产品
转基因袖莱籽,玉米及其加
工产品
转基因大豆、玉米、油莱籽
及其加工产品
转基因油藻籽、玉米及其加
工产品
SN/T 1204-2003
检测基因
CryIA(b)
6. 4 实验步率
引衡序列
5'-tccggttacgaggttett-3\
5'-ccatagatttgagcgtectte-3\5'-cgcgactgkatcaggtaca-3'
5'-tgggaacaggctcacgat3\
5'-ccgacgccgatcaccta-3\
5'-gatgccggxcgtgttgag-3\
裹1(续)
探舒序列
5'-acctalgctcaagctgccaacaccc-3\5'-ccgccgcgagctgaccctgacgtg-35'-ccgcgtgccgatggcctccgce-3
6.4. 1阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6. 4. 1. 1 阴性对照
适用范围
转基因马龄事及其加工
转基因玉米茂其加工产器
转基因大豆及其如工产品
以待测非转基因植物(如大豆、玉米、油菜籽、马铃薯、番茄、烟草)及其加工产品 DNA 为模板。6. 4. 1. 2阳性对照
采用含有待测基因序列的植物及其如工产品 DNA 作为 PCR 反应的模板,或采用含有待测基因序列的质粒。
6. 4. 1. 3 空白对照
设两个,一是提取 DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品),二是 PCR反应的空白对照(以水代替 DNA棋板）。
6. 4. 2实时荧光 PCR 反皮体系实时荧光 PCR反应体系见表 2,每个样品各做二个平行管。加样时应使样品 DNA溶减完全落人反应液中,不要粘附于管整上,加样后应尽快盖紧督益。表 2 实时荧光 PCR 反应体系
试剂名称
10×PCR反应境冲液
氧化镁(MgCl,)
dNTPs(含 dUTP)
UNG酶
引物（上游）
引物(下避)
Tag酶
DNA模板(20 ng30 ng/pL)
补水至
2.5 mmol/1.
0. 2 mmol/1.
0. 2 μmol/L
0. 2 μmnol/L
0. 1 μmol/ L
注，表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程现适当增加模板，6. 4. 3实时荧光 PCR 反应参数实时荧光定量PCR的反应参数为：37℃,5min,预变性95℃，3min，95C，15s,60℃,1min，40个循环。
注，不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当两整，4
6. 4.4收器量适道的选择：
SN/T1204-2003
PCR反应管荧光信号收集的设置,应与探针所标记的报告基团一-致。报告基团为 FAM 时,荧光信号收集应设在FAM 通道：报告基团为 TET 时,荧光信号收集应设在 TET 通道I余类推。具体设重方法图仪器而异，可照仪器便用说明书，6.4.5实时费光PCR反应运行
按预先设定的样品遥放顺序将PCR反应管依次摆故(上机前注意检查各反应管是否益紧，以免荧光物质泄漏污染仪器），开始运行仪器进行实时荧光PCR反应。6.5结果分析
6.5.1基线的设置
实时荧光PCR反应结束并分析结果后，应设重无效基线范围。无论采用任何荧光通道（FAM或TET)，基线范围选择在3个～15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况阈整基线范围。闻值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且 C, 值一40为准。6. 5. 2C 值与 DNA浓虚的关系
C. 值大于或等于 40 时,PCR 过程中无目标 DNA 的扩增 rCt 值在 36 ~40 之间,且平行样的每个值之问的差异很大,表明 PCR 反应体系中的日标 DNA 量很少,应适当增加模板量。7实时荧光 PCR定性检验的质量控制空白对照,外源基因检测 乙,值大于或等于 40,内参照基因检测C. 值大于或等于 40 t阴性对照：外源基因检测C.值大于或等于40.内参照基因检测C.值在20~~30之间阳性对照:外源基齿检测 C, 值小于或等于 34。上述指标有一项不符合者,应重做实时荧光 PCR扩增。8结果判断与衰述
8. 1结果判断
待测样品外源基因检测 C, 值大于或等于 40,内参照基因检测 C: 值在 20 ~~30 之间者,阴性对照,阳性对照和空白对照结果正常者,则可判定该样品未检出×××基因.待测样品外源基因检测 C.值小于或等于 36,内参照基因检测 C.,值在 20 ~-30 之间者,阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者,则可判定该样品检出××X基因。待测样品外源基因检测 C, 值在 36～40 之间,应重做实时荧光 PCR 扩增。 再次扩增后的结果 C,值仍小于40,且阴性对照，阳性对照和空白对照结果正常,刚可判定该样品检出×X×基因,再次扩增后结巢C,值大于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定该样品未检出X××基因8.2姑果表述
检出×X义基因，
未检出×××基因。
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