【农业行业标准(NY)】 柑橘无病毒苗木繁育规程

ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T973—2006
柑橘无病毒苗木繁育规程
Criteria for the propagation of citrus virus-free budling2006-01-26发布
2006-04-01实施
中华人民共和国农业部
http://foodmate.net言
本标准的附录A和B为规范性附录,附录C为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。NY/T973-—2006
本标准起草单位：农业部柑橘及苗木质量监督检验测试中心、中国农业科学院柑橘研究所、四川省农业厅植物检疫站、湖南省农业厅经济作物局、重庆市农业局经济作物技术推广站和广东省农业科学院果树研究所。
本标准主要起草人：周常勇、赵学源、蒋元晖、戴胜根、唐科志、杨方云、李太盛、彭炜、丁伟民、吴正亮、唐小浪。
http：//foodmate.net1范围
柑橘无病毒苗木繁育规程
NY/T973—2006
本标准规定了柑橘无病毒苗木繁育的术语和定义、要求、柑橘病毒病和类似病毒病害检测方法、脱毒技术以及无病毒母本园、无病毒采穗围和无病毒苗圃的建立和管理。本标准适用于全国柑橘产区的甜橙、宽皮柑橘、柚、葡萄柚、柠檬、来檬、枸檬（佛手）、酸橙和金柑以及以它们为亲本的杂交种的无病毒苗木的繁育。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB5040柑橘苗木产地检疫规程
GB9659柑橘嫁接苗分级及检验
3术语和定义
适栽品种commercialvariety
适合于当地栽培的柑橘品种。
原始母树originalmothertree
对病毒病和类似病毒病害感染状况尚不明确的母本树。3.3
病毒病和类似病毒病害virus and virus-likediseases由病毒、类病毒、植原体、螺原体和某些难培养细菌引起的植物病害。3.4
指示植物indicatorplant
受某种病原物侵染后，能表现具有特征性症状的植物。3.5
茎尖嫁接shoot-tipgrafting
将嫩梢顶端生长点连同2~3个叶原基，长度为0.14mm～0.18mm的茎尖嫁接于试管内生长的砧木的过程。
脱毒virusexelusion
采用茎尖嫁接或热处理十茎尖嫁接方法，使已受病毒病和类似病毒病害感染的植袜的无病毒部分与原植株脱离而得到无病毒植株的过程。3.7
无病毒母本树virus-freemothertree用符合本规程要求的无病毒品种原始材料繁育或经检测符合本规程要求的无病毒的可供采穗用的http://foodmate.netNY/T973—2006
植株。
无病毒母本园virus-freemotherblock种植无病毒母本树的园地。
无病毒采穗面virus-freeincreasingblock用无病毒母本树的接穗繁殖的苗木建立的用于生产接穗的圃地。3.10
无病毒苗圃virus-freenursery
用从无病毒采穗圃或无病毒母本园采集的接穗繁殖苗木的圃地。4要求
4.1接穗和砧木
4.1.1繁殖柑橘无病毒苗木所用的接穗和黏木的品种都是适裁品种。4.1.2紫繁殖柑橘无病毒苗木所用的砧木用实生苗。4.2柑橘无病毒苗木不带有下述病毒病和类似病毒病害4.2.1国内已有品种的苗木不带黄龙病（huanglongbing）、裂皮病（exocortis）碎叶病（tatterleaf），柑桶衰退病毒茎陷点型强毒系引起的柚矮化病（pummelodwarf）和甜橙茎陷点病（sweetorangestem-pitting）以及温州蜜柑菱缩病（satsumadwarf)。4.2.2从国外引进的柑橘苗木，除不带4.2.1所列病害外，还要求不带鳞皮病（psorosis）、木质陷孔病（cachexia）石果病（impietratura），顽固病（stubbon）杂色褪绿病（variegatedchlorosis）和来檬丛枝病（limewitchesbroom）等各种病毒病和类似病毒病害。4.3柑橘无病毒苗木不带溃病病
接GB5040规定执行。
4.4柑橘无病毒苗木的生长规格
嫁接口高度、干高、苗木高度、苗木径粗和根系生长按GB9659规定执行。5原始母树的选定
5.1适裁品种（单株系）名单由省级农业行政部门确定。5.2原始母树用适裁品种的优良单株，或具有该品种典型园艺学性状的其他单株。6原始母树感染病毒病和类似病毒病害情况鉴定6.1从原始母树采接穗，在用40目塑料网纱构建的网室内嫁接繁殖4株苗木，以备病毒病和类似病毒病鉴定和脱毒用。
6.2病毒病和类似病毒病害鉴定可采用指示植物法（见本标准7和附录A），亦可采用快速法，后者包括血清学鉴定、聚内烯酰胺凝胶电泳鉴定和分子生物学鉴定（见附录C）。6.3鉴定证明原始母树未感染本标准要求不得带有的病毒病和类似病毒病害，从该母树采接穗在网室内繁殖的苗木（同6.1），即系柑橘无病毒苗木，可用作柑橘无病毒品种原始材料。6.4鉴定证明原始母树已感染本标准要求不带的病毒病和类似病毒病害，该母树要进行脱毒。7指示植物鉴定
7.1鉴定的病害，指示植物种类（品种），鉴别症状，适于发病的温度和鉴定一植株所需指示植物株数见2
http://foodmate.net附录A。
7.2指示植物鉴定在用40目网纱构建的网室或温室内进行。NY/T973—2006
7.3指示植物中，Etrog香檬的亚利桑那861或861-S-1选系和风凰柚用嫁接苗或扦插苗，其他指示植物用实生苗或嫁接苗
7.4接种木本指示植物用嫁接接种，一般用单芽或枝段腹接，除黄龙病鉴定外，亦可用皮接。接种草本指示植物用汁液摩擦接种。
7.5在每一批鉴定中，鉴定一种病害需设接种标准毒源的指示植物作正对照，设不接种的指示植物作负对照。
7.6指示植物接种时，在一个品种材料接种后，所用嫁接刀和修枝剪用1%次氯酸钠液消毒，操作人员用肥皂洗手
7.7指示植物要加强肥水管理和病虫防治，以保持指示植物的健壮生长，并及时修剪，诱发新梢生长，加速症状表现。
7.8在适宜发病条件下，每3d～10d观察一次发病情况，在不易发病的季节，每2周一4周观察一次。7.9指示植物的发病情况，一般观察到接种后24个月为止。观察期间，如果正对照植株发病而负对照植株未发病，可根据指示植物发病与否判断被鉴定植株是否带病。在鉴定某种病害的指示植物中有1株发病，被鉴定的植株即判定为带病。8.脱毒
8.1脱毒技术
对已受裂皮病、木质陷孔病、顽固病、来檬丛枝病、杂色褪绿病或黄龙病感染的植株，采用茎尖嫁接法脱毒；对已受碎叶病、温州蜜柑萎缩病、衰退病、鳞皮病或石果病感染的植株，采用热处理+茎尖嫁接法脱毒。
8.2茎尖嫁接脱毒技术的操作
8.2.1茎尖嫁接在无菌条件下操作。8.2.2砧木准备。常用积橙或积的种子。剥去内、外种皮，经用0.5%次氯酸钠液（加0.1%吐温20）浸10min后，灭菌水洗3次，播于经高压消毒的试管内MS固体培养基上，在27℃黑暗中生长，两周后供嫁接用。
8.2.3茎尖准备及嫁接。采1cm~2cm长的嫩梢，经0.25%次氯酸钠液（加0.1%吐温20）浸5min，灭菌水洗3次后切取顶端生长点连同其下2个~3个叶原基，长度为0.14mm~0.18mm的茎尖嫁接于砧木，放人经高压消毒的装有MS液体培养基的试管中，在生长箱或培养室内保持27C、每天16h、1000Lux光照和8h黑暗条件下生长。8.2.4茎尖嫁接苗的移栽或再嫁接。试管内茎尖嫁接苗长出3个～4个叶片时，可移裁于盛有消毒土壤的盆中，或将茎尖嫁接苗再嫁接于盆裁砧木上，以加速生长。8.2.5脱毒效果的确认。从茎尖嫁接苗取枝条嫁接于指示植物，或取样用快速鉴定法鉴定其感病情说，如果垦阴性反应，证明原始母树所带病原已经脱除。所需鉴定的病害种类与原始母树所感染的相同。
8.3热处理+茎尖嫁接脱毒技术的操作供脱毒的植株每天在40℃有光照条件下生长16h和在30℃黑暗条件下生长8h，连续10d~60d后采嫩梢进行茎尖嫁接，其他步骤与8.2同。9柑橘无病毒品种原始材料的网室保存9.1网室用40目网纱构建，网室内工具专用，修枝剪在使用于每一植株前用1%次氯酸钠液消毒。工3
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作人员进人网室工作前，用肥皂洗手：操作时，人手避免与植株伤口接触。9.2每个品种材料的脱毒后代在网室保存2株～4株，用做柑橘无病毒品种原始材料。9.3网室保存的植株除有特殊要求的以外，采用积作砧木9.4网室保存植株用盆裁，盆高约30cm，盆口直径约30cm。9.5网室保存植株每年春梢萌发前重修剪一次，每隔5年6年，通过嫁接繁殖更新。9.6网室保存植株每年调查一次黄龙病、柚矮化病和甜橙茎陷点病发生情况，每五年鉴定一次裂皮病、碎叶病、温州蜜柑萎缩病和鳞皮病感染情况。发现受感染植株，立即淘汰。10无病毒母本园的建立与管理
10.1地点
10.1.1在黄龙病发生区，柑橘无病毒母本园建立在由40目塑料纱网构建的网室内，或建立在与其他柑橘种植地的隔离状况符合GB5040规定的田间。10.1.2在非黄龙病发生区，柑橘无病毒母本园建立在田间，用围墙或绿禽与其他柑橘种植地隔开。10.2无病毒母本树的种植株数
每个品种材料的无病毒母本树在无病毒母本园内种植2株一6株。10.3管理www.bzxz.net
10.3.1无病毒母本树启用的时间植株连续结果3年显示其品种固有的园艺学性状后，开始用做母本树。10.3.2柑橘无病毒母本树的病害调查、检测和品种纯正性观察以及处理方法。10.3.2.1每年10月～11月，调查黄龙病发生情况，调查病害的症状依据见附录B。10.3.2.2每年5月～6月，调查柚矮化病和甜橙茎陷点病发生情况，调查病害的症状依据见附录B。10.3.2.3每隔3年，应用指示植物或RT-PCR或血清学技术检测裂皮病、碎叶病和温州蜜柑萎缩病感染情况。
10.3.2.4每年采果前，观察枝叶生长和果实形态，确定品种是否纯正。10.3.2.5经过病害调查、检测和品种纯正性观察，沟汰不符合本规程要求的植株。10.3.3用于柑橘无病毒母本树的常用工具专用，枝剪和刀、锯在使用于每株之前，用1%次氧酸钠液消毒。工作人员在进人柑橘无病毒母本园工作前，用肥皂洗手；操作时，人手避免与植株伤口接触。11无病毒采穗围的建立与管理
11.1地点
11.1.1在黄龙病发生区，无病毒采穗圃建立在由40目塑料纱网构建的网室内，或建立在与其他柑橘种植地的隔离状况符合GB5040规定的田间。11.1.2在非黄龙病发生区，无病毒采穗圃建立在田间，用围墙或绿笃与其他柑橘种植地隔开。11.2管理
11.2.1繁殖无病毒采穗间植株所用接穗全部采自无病毒母本园。11.2.2无病毒采穗圃植株可以采集接穗的时间，限于植株在采穗圃种植后的3年内。11.2.3用于柑橘无病毒采穗面的常用工具专用，枝剪在使用于每个品种材料之前.用1%次氯酸钠液消毒。工作人员在进人柑橘无病毒采穗面工作前，用肥皂洗手：操作时，人手避免与植株伤口接触。11.2.4每年5月～6月，调查柚矮化病和甜橙茎陷点病发生情况；10月～11月，调查黄龙病发生情况，调查病害的症状依据见附录B，调查中发现病株，立即挖除4
http://foodmate.net12无病毒苗圃的建立与管理
12.1地点
NY/T973-2006
12.1.1在黄龙病发生区，无病毒苗圃建立在由40目塑料纱网构建的网室内，或建立在与其他柑橘种植地的隔高状况符合GB5040规定的田间。12.1.2在非黄龙病发生区，无病毒苗圃建立在田间，用围墙或绿筒简与其他柑橘种植地隔开。12.2管理
12.2.1繁殖苗木所用接穗全部来自无病毒采糖圃或无病毒母本园。12.2.2用于柑橘无病毒苗面的常用工具专用，枝剪和嫁接刀在使用于每个品种材料之前，用1%次氯酸销液消毒。工作人员在进入柑橘无病毒苗圃工作前，用肥皂洗手：操作时，人手避免与植株伤口接触。12.2.3苗木出面前，调查黄龙病、柚矮化病和甜橙茎陷点病发生情况，调查病害的症状依据见附录B发现病株，立即拔除。
http://foodmate.netNY/T973—2006
裂皮病
碎叶病
黄龙病
柚矮化病
甜橙茎陷点病
温州蜜相蒸缩病
鳞皮病
预固病
木质陷孔病
石果病
来橡丛枝病
杂色褪绿病
附录A
（规范性附录）
应用指示植物鉴定柑橘病毒病和类似病毒病害的标准参数指示植物种类
（品种）
Etrog香梦的亚利桑那
861或861-S-1选系
Rusk积橙
檀柑或甜橙
凤凰柚
madamayinous甜橙
白芝麻
风梨甜橙、madamivinous
甜橙、dweet橘橙
madam vinous甜橙
用快速生长的砧木嫁接
的parson专用橘
dweet橘橙、凤梨甜橙、
madam vinous甜橙
聖西哥来檬
伏令夏橙哈婚林甜橙
鉴别症状
嫩叶严重向后卷
叶部黄斑、叶缘缺摄
叶片斑驳型黄化
基术质部严重陷点
茎木质部严重陷点
叶部枯斑
叶脉班纹，有时春季嫩梢
迅遠枯荧(休克）
新叶小，叶尖黄化
嫁接口和第一次重剪后
分枝处充胶
橡叶症
芽异常萌发引起的枝叶
叶正面褪绿斑，相应反面
褐色胶斑
适于发病的温度
http：//foodmate.net鉴定一植株所需
指示植物株数
黄龙病
附录B
【规范性附录】
田间应用目测法诊断黄龙病、柚矮化病和甜橙茎陷点病的症状依据害
柚矮化病
甜橙基陷点病
血清学
分子生物学
症状依据
NY/T973—2006
叶片转绿后从叶脉附近和叶片基部开始褪绿，形成黄绿相间的斑驳型黄化发病初期，树冠上部有部分新梢叶片黄化形成的“黄梢”小枝木质部陷点严重，春梢短、叶片扭曲小枝木质部陷点严重，小枝基部易折裂，叶片主脉黄化，果实变小附录C
【资料性附录】
应用快速法鉴定柑橘病毒病和类似病毒病害法
A蛋白酶联免疫吸附法
双抗体夹心酶联免疫吸附法
双向聚丙烯酰胺凝胶电泳
多聚醇链式反应
反转录多聚酶链式反应
半巢式反转录多聚酶链式反应
温州蜜柑菱缩病
碎叶病、鳞皮病
裂皮病和木质陷孔病
黄龙病、来檬丛枝病和杂色褪绿病裂皮病、木质陷孔病、衰退病和鳞皮病碎叶病
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