【国家标准(GB)】 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法

GB/T18653
—2002
本标准是依据加拿大国家动物疾病研究所的实验室操作规程，结合本国实际情况制定的，通过大量试验，证实该方法准确可靠。
本标准的附录A是标准的附录，附录B是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标推起草单位：天津动植物检疫局。本标准主要起草人：秦贞奎、侯艳梅、张碧波227
中华人民共和国国家标准
胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法
Methods for isolation and identification of campylobactor fetus1范围
本标准规定了胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法。GB/T18653—2002
本标准适用于牛、绵羊、冷冻精液胎儿弯曲杆菌的检验，其他动物可参照使用。2胎儿曲杆菌的分离鉴定
2.1设备和材料
2.1.1混合气体［质量比为3.5%氧（O,）、10%二氧化碳（CO,）、86.5%氮（N2)]。2.1.2厌氧培养罐。
2.1.3采样棒及吸球。
2.1.42mL注射器，5号针头，20号针头。2.1.5灭菌青霉素瓶及生理盐水。2.1.6供常规细菌分离鉴定用的基本设备与材料。2.2培养基和试剂[见附录A(标准的附录)]。2.2.1增菌运输培养基（TEM)。
2.2.2半胱氨酸牛心浸膏培养基(CH)。2.2.3琼脂培养基（MH)。
2.2.4巯基乙酸盐肉汤。
2.2.5相关生化试剂。
2.3胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序见附录B（提示的附录)示意图。2.4分离培养
2.4.1样品采集
2.4.1.1母牛站立或六柱栏保定，用5%来苏儿消毒牛的外阴部，将采样棒的采样端插入阴道，压扁另一端的吸球，并来回抽动，吸取阴道粘液。取出采样棒后，插入盛有3mL灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次，再将采样棒放入消毒液中。2.4.1.2公牛六柱栏保定，用绳子固定采样侧的后肢，剪短阴简外部的阴毛，用5%的来苏儿消毒公牛的尿道口，将采样棒的采样端插入阴筒内，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取包皮液。取出采样棒迅速插入盛有3mL灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次。2.4.1.3样品液静置1min~~2min，用灭菌注射器吸取上清液2mL，分别注人两瓶增菌运输培养基（见附录A中A1)中，每瓶1 mL。振荡混勾，尽快送至实验室。2.4.1.4取样品做革兰氏染色并做湿涂片镜检。也可用棉拭子蘸取样品液直接涂布于含抗菌素的MH（见附录A中A3)或CH(见附录A中A2)琼脂平板上。2.4.2已接种样品的增菌运输培养基置37℃培养72h。用直径3mm的接种环将增菌液分别划线于两个MH或CH平板培养基上，将平板放置厌氧培养罐中，将罐内空气抽出，达到一5.5kPa时停止，充中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准228
2002-05-01实施
GB/T18653-2002
人经0.22um滤膜过滤的混合气体至负压为零，再将气体抽出和充入反复两次。将培养罐在37C培养72h。以后胎儿弯曲杆菌均需在混合气体条件下培养。2.4.3观察MH、CH培养基上有无疑为胎儿弯曲杆菌的菌落，如无可奔之。如有，将典型或可疑菌落划线于MH或CH琼脂平板培养基上培养72h。胎儿弯曲杆菌在MH或CH平板培养基上的菌落特征为：不溶血、半透明、光滑、周边整齐、圆整、直径为 1 mm左右。
2.5鉴定
2.5.1筛选试验
2.5.1.1取典型或可疑纯培养物做革兰氏染色、湿涂片动力观察、氧化酶试验及过氧化氢酶试验（试剂配方见附录A中A5、A6）。
胎儿弯曲杆菌为革兰氏染色阴性，呈螺旋状或“S”状，一些老龄培养物可出现球状或球杆状，不形成芽胞和荚膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈特征快速螺旋状穿梭运动。氧化酶试验为阳性。2.5.1.2纯培养平板用后尽快放回混合气体环境中，以备进一步做生化试验用。2.5.2生化试验
2.5.2.1将符合2.5.1.1条的培养物按表1进行生化试验。表1胎儿弯曲杆菌生化反应
过氧化氢
胎儿弯曲杆
菌胎儿亚种
胎儿弯曲杆
菌性病亚种
酶试验
“士”
硫化氢
阳性反应；
阴性反应；
反应不定；
“R”括抗；
\s\.—--敏感。
生长试验
药敏试验
萘啶酮
化钠（NaCI）酸30μg/片
马尿酸
头孢微素钠水解
30μg/片
氧化酶
2.5.2.2所有生化试验管均于混合气体环境中培养3d。带胶盖或螺旋盖的试管，培养时应将试管盖放松。
2.5.2.3生长试验：纯培养后的菌接种到2管巯基乙酸肉汤（见附录A中A4)中，分别放43℃和25℃温箱培养72h观察结果，肉汤上层出现雾状混浊时，说明细菌已生长。2.5.2.4硫化氢（H2S)试验：纯培养后的可疑菌种接种于巯基乙酸肉汤中，试管口悬吊一条长X宽为20 mm×6 mm的乙酸铅滤纸，观察 3d~~4 d，如见滤纸变黑即为产生HzS之证。2.5.2.5甘氨酸、氯化钠、胆汁生长试验：可疑菌种分别接种于含1%甘氨酸、3.5%氯化钠、1%胆汁生长的巯基乙酸肉汤中，37C培养72h，培养基近表面有云雾状生长为阳性。2.5.2.6药物敏感试验：用铂金耳挑取可疑菌落放于1mL灭菌生理盐水试管中，菌液浓度约为3×108个/ml，用灭菌1棉拭子蘸取细菌稀释液涂于MH琼脂平板上，然后用镊子把含有30μg萘啶酮酸和头孢霉素的滤纸片贴在MH血平板上，在混合气体中37C培养24h~72h，量溶菌区，Φ≥18mm为敏感，≤14mm为不敏感。
GB/T 18653-2002
2.5.2.7马尿酸钠水解试验：取48h~72h培养物接种于0.4mL1%马尿酸钠液（见附录A中A7.1）中制成浓厚菌悬液35℃C~37℃水浴2h，再加人0.2mL节三酮试剂（见附录A中A7.2），混勾后水浴20min观察结果，变深紫色为阳性，淡紫色或不变色为阴性。可用18h～24h变形杆菌培养物作阳性对照。
2.5.3结果判定
根据2.5.1和2.5.2的结果进行。2.5.3.1凡符合胎儿弯曲杆菌一般特征和生化特性的菌，均判定为胎儿弯曲杆菌。2.5.3.2过氧化氢酶试验、H2S试验、1%胆汁生长试验、3.5%氯化钠生长试验和马尿酸水解试验，其中任何一项不符合胎儿弯曲杆菌特性，均判定为非胎儿弯曲杆菌。2.6报告结果的表示
2.6.1阳性结果：“发现胎儿弯曲杆菌”“发现胎儿弯曲杆菌胎儿亚种”或“发现胎儿弯曲杆菌性病亚种”。
2.6.2阴性结果：“未发现胎儿弯曲杆菌”。230
GB/T18653—2002
附录A
（标准的附录）
培养基和试剂
A1增菌运输培养基(transport enrichmentmedium,TEM)成牛血清
5-氟尿嘧啶
放线菌酮
萘啶酮酸
多粘菌素 B
1%煌绿
1 000 mL
100 000 IU
将各种成分无菌操作加人到成牛血清中，充分混合后分装于20mL带胶皮塞（能密闭)的玻璃瓶中，每瓶8ml，然后水浴或在蒸气中加热2min～3min（无压力），使血清凝固，冷却后用灭菌玻璃棒将血清凝块捣碎。最后无菌操作充人混合气体［3.5%氧气（O2），10%二氧化碳（CO2），86.5%氮气（N，）]。将制备好的TEM培养基保存在4C冰箱中，可使用4个月。A2CH 培养基(cysteine heart blood agar)(含抗菌素）牛心浸液（或牛心粉30g）
胰蛋白陈
右旋糖
氯化钠
1、半胱氨酸
蒸馏水
pH6. 9~～7. 0
1 000 mL
加热溶解各成分后107.9kPa高压15min，培养基冷却至50℃~~55℃C时，无菌加人：多粘菌素 B
新生霉素
放线菌酮www.bzxz.net
绵羊血
混勾，倾注平板。放4C水箱备用。A3MH培养基（mueller hinton agar)（含抗菌）牛肉浸膏
酪蛋白水解物
蒸馏水
pH7.4±0.2
1 000 mL
各成分加热溶解，107.9kPa高压15min，冷却至50℃～55℃时，无菌加人：杆菌肽
25 000 IU
放线菌酮
多粘菌素 B
新生霉素
绵羊血
混匀，倾注平板。4C冰箱保存。A4巯基乙酸盐肉汤
I-胱氨酸
氯化钠
右旋糠
酵母浸膏
GB/T 18653--2002
1万IU
50 ml.~100 mL
酪蛋白胰消化物（PancreaticDigest ofCasein）筑基乙酸钠
蒸馏水
1 000 mL.
加热至溶解，调整pH7.2士0.2，5mL试管分装，107.9kPa高压灭菌15min。新制备的培养基（A1～A4)均应做无菌检查，并用已知阳性菌和阴性菌进行测试，以保证培养基的质量。
5氧化酶试剂
1%盐酸二甲苯对苯二胺水溶液，置棕色瓶中现用现配，一10℃保存，有效期一周。用于氧化酶试验。3%过氧化氢（H202)
30%H202
蒸馏水
装于棕色瓶中，有效期为一周。用于触酶试验。
马尿酸盐水解试验
A7.11%马尿酸钠
马尿酸钠
蒸馏水
A7.2水合三酮
含抗菌素MH
或 CH 培养基
报告阴性结果
GB/T18653--2002
附录B
（提示的附录）
胎儿弯曲杆菌分离鉴定程序示意图样喆
增菌运输培养基
，72h（混合气体环境）
不含抗菌素 MH
或 CH 培养基
72h（混合气体环境）
37℃1
挑选可疑菌落
72h（混合气体环境）
草兰氏染色、动力、氧化酶、过氧化氢酶试验(+)
生长试验
-项不符
报告阴性结果
革兰氏染色或
湿涂片镜检
药物敏感试验
完全符合
报告阳性结果
马尿酸盐水解试验
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