【国家标准(GB)】 牛传染性胸膜肺炎(牛肺疫)诊断技术

GB/T18649—2002
牛肺疫是由丝状支原体丝状亚种（PG1)引起的一种牛属动物的传染病。健康牛和病牛接触由呼吸道吸人病牛的“飞沫”，是本病的主要传染方式和感染途径。暴发流行时多呈急性病演，呼吸系统症状非常明显，体温在41℃以上稽留。但在病的常在地区多见亚急性和慢性病程，以地方流行性为特点。急性期病变为浆液渗出性纤维素性胸膜肺炎，肺间质多孔多汁，肺小叶出现各期肝变、多色，呈大理石样肺，肺胸膜和肋胸膜粘连，以及胸腔渗出液大量潴留为特征。转为慢性后逐渐形成肺包膜或坏死块。慢性病牛长期带菌，成为隐蔽的传染源。在新发的地区对此病的检验应采取流行病学、临床学、血清学、病理学和病原学综合诊断方法为宜。世界动物卫生组织[World Organization for Animal Health(英）,Office Intentional des Epizootic(法），0IE］于1986年和1992年推荐采用稍加改进的Campbell和Turner的补体结合试验作为牛肺疫血清学诊断的方法，但常出现非特异性反应。新中国成立后一直采用补体结合试验检验牛肺疫，并于1979年将该法列入农业部颁布的《动物检疫操作规程》中，但这种方法常出现1%~～2%非特异性反应。近年来我国研制成功了特异性高的微量凝集反应检验方法，它不但降低了非特异性反应率，而且操作简便，容易判定，应用效果良好。病原学诊断主要取病牛肺脏，胸腔渗出液和肺门淋巴结接种马丁培养基，即可分离出牛肺疫病原体，此法对急性期病例的检出率可达100%。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人：白文彬。
中华人民共和国国家标准
牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫)诊断技术Diagnostic techniques for contagious bovine pleuropneumonia1范围
GB/T18649—2002
本标准规定了牛传染性胸膜肺炎的病原学检查、补体结合试验、微量凝集试验诊断技术要求本标准适用于牛传染性胸膜肺炎的检验。病原学检查适用于急性、亚急性及慢性病牛分离病原体，补体结合试验和微量凝集试验适用于牛肺疫抗体的检测。2病原学检查
2.1材料准备
培养基：10%马血清马丁肉汤，10%马血清马丁琼脂［见附录A(标准的附录)]。2.2病料采集
2.2.1用灭菌器械（剪力、镊子、吸管、青霉素瓶等）无菌采集肺脏、胸腔渗出液、肺门淋巴结，并将肺病料剪成3cm～5cm方块。胸部淋巴结，以整个淋巴结为好，胸腔渗出液用吸管吸人青霉素瓶内。2.2.2受检病料的保存：肺和淋巴结保存在用茶色广口瓶盛装的灭菌的40%~~50%甘油生理盐水中，胸腔渗出液不加任何保存液。病料均放人冰箱内保存，并应尽快送往实验室检验。2.3培养方法
在无菌条件下剪肺病料或淋巴结小块，用铂金耳钓人10%马血清马丁肉汤内；胸腔渗出液用灭菌吸管吸取0.1mL～0.3mL接种于马丁肉汤中即可。同时取剪碎病料小块或直接取胸腔渗出液，用铂金耳在10%马血清马丁琼脂培养Ⅲ上划线接种，培养皿用胶布封口，置37℃～38C培养，每天观察一次，5d～7d后判定。
2.4结果判定
2.4.1培养特征
2.4.1.1培养性状和菌落形态：牛肺疫病原微生物在10%马迦清马丁肉汤内生长初期呈轻微混浊或呈白色点状、丝状生长，以后逐渐均匀混浊，半透明稍带乳光，不产生菌膜或沉淀，也无颗粒悬浮。在10%马血清马丁琼脂培养皿上生长迟缓，为极小的水滴状圆形略带灰色的微细菌落，中央有乳头状突起。菌落直径约0.2mm~0.5mm，小的不易看见，需用放大镜或低倍显微镜观察。2.4.1.2染色镜检取马丁肉汤培养物涂片放温箱中干燥，后在酒精灯上轻微火焰固定，再用3%~~5%铬酸蒸馏水溶液固定1min~2min，水洗，浸人用蒸馏水稀释的1：30的姬姆萨氏染液中染色，染片时染色缸放人普通冰箱内过夜，染色后取出用蒸馏水轻洗，自然干燥后用800～1000倍显微镜观察。菌形为多形态，以球点形最常见，大小在125nm～250nm。2.4.2生化特性
2.4.2.1糖发酵试验
2.4.2.1.1取蛋白陈水（pH7.8~8.0)100mL，氯化钠0.5g所需各种糖类0.5g～1.0g。溶解各成分，加入1.6%溴甲酚紫酒精溶液指示剂0.1mL混勾，分装三分管内装2mL，管内装有倒置的小玻璃中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准208
2002-05-01实施
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管（杜汉氏发酵管）。经106.4kPa20min灭菌。2.4.2.1.2在进行糖发酵试验时，首先将各种糖培养基小管加无菌的马血清0.2mL，再加受检的菌液0. 1 mL 置 37℃~38℃下培养 5 d~7 d。.2.4.2.1.3结果判定：牛肺疫菌可轻度分解葡萄糖、麦芽糖、糊精、淀粉产酸使培养基变黄，而不产气；不能分解果糖、蔗糖、蕈糖、单奶糖和杨苷。2.4.2.2硫化氢(HS)试验
2.4.2.2.1乙酸铅纸条的制备：取滤纸剪成6.5cm×0.6cm大小的纸条，置平血中，经112kPa20min灭菌，烘干，再将滤纸条浸泡在灭菌的饱和乙酸铅溶液（10g乙酸铅溶于50mL沸蒸馏水中，即为饱和乙酸铅溶液），浸透后取出，置无菌平皿内，37℃烘干，保存于灭菌的试管中。2.4.2.2.2试验方法：受试菌接种于10%马血清马丁肉汤或琼脂斜面上，取一片乙酸铅滤纸条，夹在试管的棉塞下悬挂，置37℃培养5d~~7d，滤纸条变黑或棕揭色者为阳性反应。2.4.2.3硝酸盐还原试验
2.4.2.3.1培养基的准备：取营养肉汤或马丁肉汤100mL，硝酸钾(KNO)0.1g，调pH至7.8~8.0,分装试验管，112kPa20min灭菌。2.4.2.3.2试剂的准备：
试剂1，甲液：对氨基苯磺酸0.5g，5mol/L乙100mL，乙液：α-萘胺0.5g，5mol/L乙酸100 mL.
试剂2，二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100mL浓硫酸中,用20mL蒸馏水稀释。2.4.2.3.3试验方法。首先向硝酸盐培养液中加10%无菌马血清，然后将试验菌接种于硝酸盐培养基中，同时设不接种的对照管，于37C培养5d7d。于5d和7d时取培养液少许放人干净的小试管中，再各滴一滴试剂甲液和乙液，对照管同样加试剂。若试管菌液呈现红色，橙色者为阳性反应；如无红色出现，则可加一二滴二苯胺试剂，若呈现蓝色反应，则表示培养基中有硝酸盐存在；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐已被还原成其他物质，则仍按硝酸盐还原试验阳性反应。2.4.2.4靛基质试验
2.4.2.4.1培养基准备：蛋白陈1g，氯化钠0.5g，色氨酸0.1g，蒸馏水100mL。溶解各成分，调pH至7.8~~8.0分装试管，经106.4kPa20min灭菌。2.4.2.4.2试剂：对二甲基氨基苯甲醛5g,95%乙醇75mL，浓盐酸25mL。对二甲基氨基苯甲醛溶于乙醇中，再缓缓加人浓盐酸即成。2.4.2.4.3试验方法；先向培养基中加人10%无菌马血清，再将试验菌接种于培养基中，37C培养5 d～7 d后，滴加试剂数滴于培养物液面，轻轻摇动，红色为阳性反应。黄色为阴性反应。2.4.2.5甲基红(MR)试验www.bzxz.net
2.4.2.5.1培养基：蛋白陈0.7g，葡萄糖0.5g，磷酸氢二钾0.5g，蒸馏水100ml。各成分溶解后，调pH7.8~8.0,分装试管。经106.4kPa20min灭菌备用。2.4.2.5.2试剂：甲基红0.02g95%酒精60mL，蒸馏水40mL。先将甲基红研磨溶解于酒精中，再加蒸馏水即成。
2.4.2.5.3试验方法：按10%量向培养基中加无菌马血清，再接种试验菌，37℃培养5d～7d。于第五天时取少许培养液于另一支试管中，并几滴试剂，如培养液呈现红色为MR试验阳性；黄色者为阴性，继续培养至第7天，再进行试验。2.4.2.6维培二氏(VP)试验
2.4.2.6.1培养基与MR试验相同。2.4.2.6.2试剂与方法：可用下列三种试剂进行VP试验：a）Barritt's试剂法。甲液：6%α-萘酚酒精溶液。乙液：40%氢氧化钾溶液。取MR试验的同一培养物约2mL，加甲液1mL，乙液0.4mL，充分混合，在5min内呈粉红色反应为阳性。209
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b）O'Meara's试剂法：氢氧化钾（或氢氧化钠）40g，肌酐（creatine)0.3g，蒸馏水100mL。取上述同一培养物约2mL加等量试剂相混合，充分振荡试管，在5min内呈粉红色者为阳性反应。c）硫酸铜试剂法，硫酸铜1g，浓氨水40mL，10%氢氧化钾960mL。硫酸铜溶化于40mL浓氨水中，加10%氢氧化钾960mI即成。试验时加等量的试剂于培养物中混合，在5min内呈粉红色反应为阳性。上述三种方法为阴性，继续培养，再行观察。3补体结合试验
3.1材料准备
3.1.1稀释液：系用常规方法配制0.85%生理盐水。3.1.22.5%绵羊红细胞悬液：无菌采集绵羊血，脱纤经两层纱布过滤后，用生理盐水洗涤3次，每次2000r/min离心，10min，最后用生理盐水将红细胞泥配成2.5%悬液。3.1.3抗原、标准阳性血清，阴性血清、溶血素，按说明书使用。抗原效价滴定方法见附录B（标准的附录）。溶血素效价滴定见附录C(标准的附录)。3.1.4补体：效价滴定方法见附录D（标准的附录）。3.1.5标准溶血管的制备；见附录E(标准的附录）。3.2操作方法
3.2.1被检血清、标准阴、阳性血清均用灭菌生理盐水作1：5稀释于60 C水浴锅中灭活30min。3.2.2，每份被检血清用两支康氏管或三分管（10mm×100mm），每管加人1：5稀释的灭活血清0.25.mlc
3.2.3其中一管加工作量抗原0.25mL，另一管加生理盐水0.25mL。3.2.4每管加人工作量补体0.25mL。3.2.5摇匀，放37℃～38℃水浴20min。3.2.6每管加人二单位溶血素0.25mL。3.2.7每管加入2.5%红细胞悬液0.25mL。3.2.8摇匀,37℃～38℃水浴20min。3.2.9设标准阳性血清、阴性血清、补体对照（包括抗原、盐水)以及红细胞对照。主试验操作程序、各要素加人量见表1。表1
T.作量抗原
工作量补体
生理盐水
二单位溶血素
2.5%红细胞
被检血清
主试验操作程序
阳性血清
阴性血清
振荡后37C~38℃水浴20min
振荡后37℃~38℃水浴15min
（比色判定）
注：对照3～8管及红细胞管每次试验只作一组。210
补体对照
红细胞对照
3.3判定标准
3.3.1初判和终判
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3.3.1.1初判：试验完毕后取出立即进行第一次判定。对照管中阳性血清加抗原应完全抑制溶血“十十十十”，其他对照管完全溶血，证明试验操作中无误。
被检血清对照管发生不完全溶血或完全抑制溶血时，此份血清应复试。若本试验管完全溶血则判为阴性。如不完全溶血或完全抑制溶血时放室温冷暗处静置12h进行第二次判定。3.3.1.2终判：将被检血清管与溶血度标准比色管比较上清液色调和红细胞沉积量，以决定溶血程度而作最终判定。
3.3.2溶血程度的判定标准
血清1：5稀释溶血程度的0～50%溶血判为阳性；血清1：5稀释溶血程度的60%~~80%溶血判为可疑；血清1：5稀释溶血程度的90%~～100%溶血判为阴性；可疑者重检，若仍为可疑可判为阳性。4微量凝集试验
4.1材料准备
4.1.1稀释液，系用常规方法配制的0.85%生理盐水。4.1.2抗原、标准阳性血清、阴性血清按说明书使用。4.1.3DY-I型25μL加样器，酶标反应板或微量滴定板（微量板）。4.2操作方法
4.2.1被检血清、标准阳性血清、阴性血清用灭菌生理盐水作1：4或1：5稀释，经56℃~58℃灭能30 min。
4.2.2抗原用灭菌生理盐水稀释成工作量（1，8）。4.2.3用微量加样器吸取被检血清25μl，加人微量板的个孔中。4.2.4加工作量抗原25uL于同一孔内，即每头份被检血清用一个孔。4.2.5每板设阴、阳性血清和生理盐水对照。4.2.6轻轻摇动反应板混匀，放室温暗处或4℃～8℃冰箱内5h～20h左右。4.3判定
4.3.1判定标准
4.3.1.1凝集程度：“+++十”为100%凝集；\+++”为75%凝集；“++”为50%凝集；“+”为25%凝集；“”为不凝集。
4.3.1.2判定方法：判定前轻轻振动反应板，静置3min~5min即行判定。判定时用8W日光灯照明，手持反应板，借助侧光在黑色背景上判定或用凝集反应箱观察。受检血清出现阳性反应的需重复试验一次，如两次结果不一致时，应再复试一次，以两次以上试验结果一致时为准。
4.3.2在阴、阳性血清和生理盐水对照正确的情况下，被检血清出现“十十”以上凝集的判为阳性；“十”和“—”为阴性反应。
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附录A
(标准的附录）
培养基
A110%马血清马丁肉汤（pH7.8～8.0)将制备的马丁肉汤分装于灭菌试管内，每管4.5mL，添加无菌马血清0.5mL。
A210%马血清马丁琼脂：马丁肉汤中加人琼脂，使含量达1.3%~1.5%，经121kPa高压灭菌30min即成马丁琼脂。在灭菌的6cm～8cm直径培养血内加无菌马血清1mlL，再添加煮沸融化降温至55C～60C的马丁琼脂9mL，轻轻摇动混合均匀，静置凝固后即成马丁琼脂培养基。附录B
（标准的附录）
抗原效价测定
按兽医生物药品厂判定的效价，在每批初次使用时重新测定，以后可每三个月测定一次。牛肺疫标准阳性血清按表B1稀释，阴性血清作1：5稀释后，置56℃～58℃灭活30min。阳性血清稀释
稀释倍数
血清量 /mL
生理盐水/mL
抗原先根据原测定的效价稀释为工作抗原，再按表B2稀释。表B2抗原稀释
工作抗原/mL
稀释液/mL
然后按表B3程序加入试验成分进行抗原效价的测定。c
表B3抗原效价测定
1：5 阳性血清
1：10阳性血清
1:20阳性血清
1：40阳性血清
1：60阳性血清
1 : 5 阴性血清
工作量补体
生理盐水
二单位溶血素
2.5%红细胞
抗原稀释
振荡后37℃~38℃水浴20min
抗原对照
1：5阳性血清
1：10阳性血清
[1：20阳性血清
1：40阳性血清
1：60阳性血清
1: 5阴性血清
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表B3（完）
抗原稀释
振荡后37℃~38C水浴20min
抗原对照
抗原效价判定：如表B3所示，抗原效价系指抗原80%稀释液在标准阳性血清1：10的稀释液中，能产生完全抑制溶血现象（十+++），并在1：40的稀释液中产生50%以上抑制溶血现象（++）者，此效价抗原即为工作量抗原。
在阴性血清和不加血清的抗原对照管中均应完全溶血，如抗原对照管发现有抑制溶血现象时，则认为该批抗原有抗补体作用，不能使用。如试验结果发现抗原效价不足时，可继续试验其他浓度较高的抗原稀释液，如原判定效价为1：13稀释，经测定效价不足，可以提高浓度为1：12、1．11、110，再按上述方法测定。附录C
(标准的附录）
溶血素效价的滴定
取0.2ml.溶血素（含等量甘油）加9.8mL生理盐水混合成100倍基础液，其稀释方法见表C1。表C1
试管号
稀释度
1:100溶血素
生理盐水
溶血素稀释法
1.500110001.15001.20001.25001.30001.350019
:40001-45001:5000
按照表C2顺序加人各种试验成分，在37℃~~38℃水浴15min。能使0.25mL的红细胞液完全溶血的溶血素最小量（最大稀释度)称为一单位。如表C2举例栏中第6管完全溶血，而对照管都没有溶血现象，则该批溶血素的效价即为1：3000，使用两单位溶血素则为1：1500。表C2
溶血素效价测定
试管号
溶血素
稀释度
溶血素用量
1：20补体
1:5001:10001:15001:20001:2500|1:30001:35001:40001:45001:50001:1000.25
2.5%红细胞
生理盐水
结果判定
0. 500.50
振荡后37℃~38℃水浴15min
注，“+”抑制溶血“±\部分溶血，“\”全部溶血。
补体用生理盐水作10倍稀释。
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附录D
（标准的附录）
补体效价测定
阴性血清、阳性血清，作1：5稀释，56℃~58℃灭活30min。测定时放四列试管，两列阴性血清（一一列加抗原、一列不加抗原，以生理盐水补足其量）两列阳性血清（一列加抗原、一列不加抗原，以生理盐水补足其量），以阳性血清加抗原为例，按表D1操作。表D1补体效价测定
10×补体
生理盐水
抗原（工作量）
5×阳性血清
5×阴性血清
二个单位溶血素
2.5%红细胞悬液
阳性血清加抗原
阳性血清未加抗原
阴性血清加抗原
阴性血清未加抗原
0. 250. 250. 25
0.2510.25
振荡均勾后置37℃~38℃水浴中20min0.25
振荡均匀后置37℃～38℃水浴中20min25
在两单位溶血素存在的情况下，可使阳性血清加抗原的试管中完全不溶血，而在阳性血清未加抗原的试管及阴性血清无论有无抗原的试管中发生完全溶血，所需最小补体量，就是补体工作量。如表D1中的第6管，10倍稀释的补体0.10mL即为工作量，按式(D1)计算原补体，在使用时应稀释的倍数：补体稀释倍数
原补体应稀释倍数=
×使用时每管加人量
测得效价
上列公式计算：0.10×
X 0. 25 25
即此批补体应作25倍稀释每管加0.25mL即为工作量补体或一个补体单位，因补体性质极不稳定在操作过程中效价会降低。故使用时稀释的浓度比原效价高10%左右，因此本批补体应作1：22倍稀释，每管加0.25mL。
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附录E
(标准的附录）
标准溶血管的制备
为了正确判定溶血程度，可以利用试验中完全溶血的溶液混合，作为溶血溶液。按表E1配制。表E1
试管号
溶血溶液
2.5%红细胞
生理盐水
溶血/%
判定符号
判定标准
溶血度标准比色管配制法及比较判定结果标准3
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