【国家标准(GB)】 非洲猪瘟诊断技术

GB/T18648-2002
非洲猪瘟（African swine fever，简称ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病。其特征为病程短，病死率高，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。为世界动物卫生组织［WorldOrganizationforAnimalHealth（英），Office Intentionaldes Epizootic（法），OIE和我国规定的动物一类疾病。病毒在鲜肉和腌肉中能存活数月。
ASF的实验室诊断分为两类：第一类包括病毒分离、病毒抗原和基因组 DNA的检测；第二类包括抗体的检测。试验方法的选择主要依据本国或本地区的疾病情况而定。在没有ASF但又怀疑该病存在的国家，实验室诊断必须应用无感染性的诊断方法，即应用聚合酶链反应（PCR）检测病毒基因组DNA和应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体。我国是无ASF国家，目前尚无ASF的检疫方法。农业部动物检疫所于1997年与美国梅岛动物病研究中心进行了ASF的无感染性快速检测方法的合作研究，建立了适合于我国使用的由可疑感染动物血液和内脏器官中直接检测ASFVDNA的PCR技术，以及检测血清中ASFV抗体的ELISA方法。本标准对这两种方法技术要求作了规定。本标准的附录A、附录B和附录C都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标准主要起草人：蒋正军、王树双、尹燕博、蔡丽娟、郭福生、陆明哲、孙淑芳、龚振华。202
1范围
中华人民共和国国家标准
非洲猪瘟诊断技术
Diagnostic fechniques for African swine feverGB/T18648—2002
本标准规定了非洲猪瘟（ASF）聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)的技术要求。本标准适用于生猪和野猪等易感动物及其产品ASF的诊断和检疫。2PCR试验
2.1材料准备
2.1.1样品DNA制备方法见附录A(标准的附录）。2.1.2电泳液缓冲液的配制方法见附录B(标准的附录）。2.1.3标准ASFV-BA，株DNA、引物1、引物2、1.25mmol/LdNTP和载样缓冲液。2.1.4台克(Taq)DNA聚合酶、分子量为100碱基对（bp)Ladder(标准DNAMarker)0和10倍浓度的聚合酶链反应(PCR)扩增缓冲液。2.1.5自动DNA热循环仪。
2.2操作方法www.bzxz.net
2.2.1将下列试剂按要求量加人到0.75mL的离心管中：灭菌蒸馏水（24.5μl);10倍浓度的PCR扩增缓冲液（5μL）;1.25mmol/LdNTP贮存液（8μL）；引物1（1μL）；引物2(1μL）；样品DNA溶液(10 μL)(见附录 A);Taq DNA 桑合酶(0.5μL)。2.2.2设定两个对照，阳性对照为标准的ASFV-BA，株的10uLDNA含量为10fg；阴性对照为不含DNA的灭菌蒸馏水10μl.。
2.2.3取50μl.矿物油覆盖在混合液上。2.2.4将加有样品或对照混合物的Eppendorf管放人自动DNA热环仪中，按下述程序和条件进行DNA扩增：94C5min.50C2min，72℃C3min循环一次;94C1min,50℃2min,72℃C3min循环30次;94℃C1min，50℃2min，72℃10min循环一次，最后置于4℃保存。2.2.5上述步骤完成后，从矿物油下小心取出每种反应混合物20μL，放人另→支干净的Eppendorf管中并加2μL载样缓冲液。
2.2.6将所有样品按编号加人到对应2%琼脂凝胶(见附录B1)板的各孔中，其中一孔加标准阳性DNA样品，在凝胶的边孔中加人标准分子量DNAMarker。2.2.7将凝胶在150V恒定电压下电泳2h。2.2.8结果判定：用紫外光源检查凝胶。如为阳性样品，则出现一条孤立的、与阳性对照PCR产物的同步迁移的带，分子量为265bp。阴性对照和非ASF感染猪无265bp带。3酶联免疫吸附试验（ELISA）
3.1试剂：标准抗原。
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准2002-05-01实施
GB/T18648--2002
3.20.1mol/L磷酸盐缓冲液（制备方法见附录C1），底物溶液（见附录C2）。3.3操作方法
3.3.1取ELISA微量滴定板，每孔加入用0.1mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液稀释至工作滴度的抗原溶液50μL，封板后于4℃作用16h（过夜）。3.3.2用pH7.2的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗板3次，每次2 min。3.3.3用含0.05%吐温-20的0.1mol/1.磷酸盐缓冲液溶液，将待检血清以及阳性和阴性对照血清作30倍稀释，将稀释的血清加人用抗原包被的孔中，每孔中加50μL。3.3.4将滴定板放在微量振荡器上，37C作用30min，然后用0.1mol/1.磷酸盐缓冲液洗3次。3.3.5每孔加人50uL用含0.05%吐温-20的0.1mol/1.磷酸盐缓冲液配制的免疫球蛋白G（IgG）抗猪过氧化物酶结合物溶液。
3.3.6将滴定板放入振荡器，37℃作用于1h，然后用0.1mo1/L磷酸盐缓冲液洗3次。3.3.7每孔加50μL底物溶液。
3.3.8室温下显色15 min。
3.3.9每孔加50μl,1mol/l的硫酸终止反应。3.3.10判定结果：阳性血清可以用肉眼辩认，为清亮的黄色，用ELISA检测仪检测每一孔的光吸收值，检测波长为492nm。任何一种血清，只要它的吸收值超过同一块板中阴性对照血清平均吸收值的两倍，就可判为是阳性。
GB/T18648—2002
附录A
（标准的附录）
样品DNA的制备
A1将组织放人有灭菌沙子的研钵中研磨成糊状，加5mL10mL含1%牛血清0.1mol/LpH7.2的0.1mol/l.磷酸盐缓冲液，对研碎的组织作10倍稀释，制成组织悬液。A2全血样品可用含1%牛血清的0.1mol/L磷酸盐缓冲液作1：1000倍稀释，制成悬液。如为污染物的样品，如粪便等用以上0.1mol/L磷酸盐缓冲液作10倍稀释，制成悬液。A3
A4 500 r/min 离心 5 min
A5取500μl.加入有螺旋帽的离心管中，煮沸10min。A6用小型高速离心机以13000r/min离心5min。A7取10μL上清液用作PCR试验的样品DNA。附录B
（标准的附录）
电泳缓冲液的配制
B1琼脂糖凝胶的TAE缓冲液(50倍）三羟甲基氨基甲烷碱（Tris base）冰乙酸
0.5 mol/1.(pH8.0)乙二胺四乙酸(EDTA)蒸馏水
待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000ml，置4℃冰箱中备用，如配制2%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍成TAE缓冲液。B22%琼脂糖凝胶板制备
取1g琼脂糖（电泳纯)加入至50mLTAE缓冲液中，在微波炉中充分溶解后，加人最终浓度为0.5μg/mL的溴化乙锭，用TAE定容至50mL,冷却至60℃后，倒人凝胶板中，在距离底板0.5mm的位置上放置梳子，以便加人琼脂糖后可以形成完好的加样孔子，凝胶的厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放人电泳槽中，加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。附录C
（标准的附录）
酶联免疫吸附试验溶液配制
C10. 1 mol /L磷酸盐缓冲液的配制将下列试剂按次序加人2000mL体积的容器中。氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
双蒸馏水
GB/T 18648-2002
混匀，用pH试纸调pH至7.2,用双蒸馏水定容至1000ml.。底物溶液［邻苯二胺-过氧化氢（OPD-H2O2）C2
C2.10.1mol/LpH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液将下列试剂按次序加人1000mI.体积的容器中，充分溶解即成，磷酸氢二钠(Na2HPO.·12H,O)
柠檬酸
蒸馏水
C2.2底物溶液
1000ml
0.1mol/LpH5.0磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液邻苯二胺(OPD)
30%（过氧化氢）（H,0,）
此液对光敏感，应避免强光直射。现配现用。206
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