【国家标准(GB)】 谷物和谷物产品 α-淀粉酶活性的测定 比色法

中华人民共和国国家标准
谷物和谷物产品α-淀粉
酶活性的测定
比色法
Method for determination of alpha-amylaseactivity in cereal and cereal products-Colorimetric method
GB 5521—89
代替 GB5521—85
本标准等效采用国际标准ISO 3983一1977《谷物和谷物产品α-淀粉酶活性的测定比色法》。1主题内容和适用范围
本标准规定了用比色法测定谷物和谷物产品α一淀粉酶活性所用仪器、试剂、分析步和结果计算。
本标准适用于测定谷物和谷物产品α-淀粉酶活性，也可用于测定源于真菌或细菌的α-淀粉酶干粉的活性。
2定义
1L溶剂从1g样品中所提取的酶，在规定条件下，每秒钟降解1.024×10-5单位的β-极限糊精底物溶液，则该样品的α一淀粉酶活性等于一个单位，极限糊精是被β一淀粉酶完全降解了的淀粉产物。
3原理
酶降解β一极限糊精底物溶液，经过不同的反应时间，将反应混合物等分加到碘溶液中。随着反应时间的增加而使颜色强度降低，以测定酶活性。，。试剂
碘(GB 678—77);
碘化钾（GB1272—77)；
4.3冰乙酸(GB 676-78);
硫酸（GB 625—78);
4.5’无水乙酸钠（GB694一81)，4.6氯化钙，
4.7可溶性淀粉\
注：1）可采用Liatner淀粉或质量相当的国产可溶性淀粉。逝江菱湖化工试剂广产品符合要求。4.8浮石粉，
.4.9碘贮备液：
称取11.0g碘化钾溶于少量水中，加人5.50g结晶碘，搅拌至碘完全溶解。再定容至250mL，置于棕色瓶中，在暗处贮存，此溶液可保存一个月；:4.10碘稀释液：
称取40.0g碘化钾溶于水中，加4.00mL碘贮备液，并稀释至1L，用时现配，不可过夜，中华人民共和国商业部1988-12-31批准284
1989-09-01实施
GB5521-—89
4.11缓冲液：
称取164g无水乙酸钠溶于水中，加人120mL冰乙酸用水定容至1L4.120.2%（m/V）氯化钙溶液，
4.130.05mol/L硫酸溶液
4.14β-淀粉酶溶液：
称取10g有酶活性的黄豆粉（粗细度为通过1.5mm孔筛），加人85mL水和15mL0.05mol/L硫酸充分搅匀，静置15min，抽滤，该滤液用于制备β-极限糊精底物溶液，4.15B-极限糊精底物溶液：
称取5.00g（千基）可溶性淀粉于小烧杯中，加人约20mL水混匀，将其边搅拌边缓慢倒人盛有100mL沸水的500mL高型烧杯中，并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移至高型烧杯中，继续搅拌并加热，缓慢煮沸2min。加盖表面血，在自来水中冷却至30℃以下，加人25mL缓冲溶液及50mLβ-淀粉酶液，在室温下放置20h，加人1勺浮石粉，将此溶液在10min之内缓慢煮沸，然后继续沸腾5min以上。冷却至30℃以下，用水定容至250mL，摇匀，过滤。滤液中加几滴甲苯，此溶液的pH值应为4.7±0.1，在25℃以下可连续使用五天。5仪器
恒温水浴，30±0.1℃，
恒温水浴，20±0.1℃
分光光度计或比色计，
秒表，
筛子：孔径为1.0mm，1.5mm，bzxz.net
5.6 pH计。
6分析步骤
6.1分光光度计及其空白调整：
将分光光度计连接稳压电源，预热20min，调整波长为575nm。将2.0mL氯化钙溶液加到10.0mL稀碘溶液中，然后以适盘的水V。稀释（加水量一般为20～40mL，V。详见6.2），混匀后达到20℃，用1cm比色皿进行测试，调节仪器狭缝宽度，使吸光度为零。6.2底物溶液的校准：
分别吸取5.0mLβ-极限糊精溶液和15.0mL氯化钙溶液于一个100mL烧杯中，混勾取出2.0mL混合液至另一个100mL烧杯中，加人10.0mL稀碘溶液和适量的水，混匀置于20℃水浴中，用1cm比色Ⅲ在波长575nm处，以6.1所用溶液为参比，测其吸光度。调整加水量，使测得的吸光度在0.55～0.60之间，如果测得吸光度大于0.60则增大加水量，如果测得值少于0.55则减少加水量。通过反复试配，直至测定的吸光度值在0.55～0.60之间，记下此时的加水量Vo，并用它调整空白溶液的加水量V。即为该β-极限糊精测试时的加水量。6.3α-淀粉酶的提取：
称取谷物样品约5g（精确到0.05g），倒人300mL锥形瓶中，加人预热到30℃的氯化钙溶液100土0.5mL，充分摇匀，置于30℃的恒温水浴中。在15、30、45min时从水浴中取出，上下颠倒锥形瓶10次，重新置于水浴，共提取60min。取出过滤，滤液即为酶提取液。6.4α-淀粉酶活性测定：
把酶提取液和β-极限糊精溶液置于30℃水浴中，10min后用快速移液管吸移5.0mLβ-极限糊精溶液至盛有15.0mL酶提取液的锥形瓶中，加塞后播匀。在加液的同时，用秒表计时。吸取10.0mL稀碘溶液于各个50mL容量瓶中，加人VmL水，混匀加塞后置于20℃水浴中，每隔5min或10min进行下列操作：
GB 5521-89
6.4.1吸取2.0mL酶、β-极限糊精混合液到一个盛有稀碘溶液和V。mL水的容量瓶中,摇匀后置于水浴，使溶液温度达到20℃。
6.4.2倒入比色皿测其吸光度。
7结果计算
7.1计算公式：
α一淀粉酶活性由下式求得：
500×f
式中，A——α-淀粉酶活性，单位，m
100mL氯化钙提取的试样质量，g，h——试样中水分含盘，%，
f-一酶提取液的稀释倍数;
t1、t2—-不同的反应时间，min，D、Dz-—时间t1、 2时的吸光度，b———lg D对t的曲线的斜率的绝对值，500——系数。
Ig Di - Ig D2
7.2计算举例：
含14.6%水分的样品5.20g，用100mL氯化钙溶液提取。由于酶提取液与极限糊精的反应速度太快，故用氯化钙溶液稀释酶提取液，1份酶提取液加1.5份氯化钙溶液。因此f=1+1.5=2.5。β~极限糊精与酶提取液混合后，间隔5，10和20min后，吸光度分别为：时间，min
根据5min和10 min后的观察结果：b=
吸光度D
0.697 -0.628
用三个观察结果作lgD对t的曲线（见图）。把b=0.01391代入公式得：
4= 500×2.5×0.01391
IgD+ 1
=0.0138min-1
3.9单位
7.3结果的重复性，
GB 5521-89
b = I&D -ig D,
时间，min
=0.01391min
吸光度D
同一实验室同时或连续两次测定结果之差，不得超过平均值的10%，如果两次测定结果符合要求，则取结果的平均值。按下表修约：活性，单位
50~500
500~5000
5000~50000
修约成整数范围，单位
注：①测定过程中应合理调整酶的浓度，使35%~60%的β-极限糊精在15~40min内降解,即最后测得的吸光度为底物校准时吸光度的40% ~ 65 %。如果吸光度降得太快，则酶液可用0.2 %的氯化钙溶液再稀释。如酶的活性太低，为获得正确结果，可将反应时间延长到60min以上。②在用分光光度计测定吸光度时，溶液的温度对结果有影响，必须控温在20℃，在6.4的操作中，从显色到测定吸光度的间隔时间一般对结果没有影响，如测定一系列样品，可在所有样品均完成显色后再一起测定吸光度。但长间隔时间不得超过1h。287
附加说明：
GB5521—89
本标准由中华人民共和国商业部粮食储运局提出并归口。本标准由商业部谷物油脂化学研究所起草。本标准主要起草人王维光。
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