【国家标准(GB)】 保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

ICS67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.171—2003
保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
Determination of the action of superoxide dismutase in health foods2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准负责起草单位：吉林市卫生防疫站、吉林医学院。本标准第一法主要起草人：袁彦华、罗速、于敬伟、孙连军、赵凤明。本标准第二法主要起草人：罗速、袁彦华、张吉林、卢忠魁。GB/T5009.171—2003此内容来自标准下载网
GB/T5009.171—2003
超氧化自由基O可以造成机体细胞损伤。超氧化歧化酶（SOD）能够清除机体内O。食品中SOD活性的测定，国内外尚无标准检验法。因此，卫生部九五制标规划确定了食品中SOD活性测定的研究课题。
本标准以修改的Marklund方法和化学发光法测定食品中SOD活性。前者SOD活性测定最低检出浓度为1.17U/mL，相当于1.1×10-mol/L，方法灵敏，仪器价廉，操作简单，易于推广，后者SOD活性测定最低检出浓度为0.033U/mL，相当于3.0×101°mol/L,灵敏度比前者提高约二个数量级。具有更加灵敏、快速和干扰少等优点，但试剂较贵，可应用于仲裁或科研。两种测定方法对同一SOD酶测定结果无显著差异（P>0.05）。412
1范围
保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
本标准规定了食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定方法。本标准适用于各类食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定。本方法第一法检出限1.17U/mL，第二法检出限0.033U/mL。第一法修改的Marklund方法
2定义
25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为一个活力单位。3原理
GB/T5009.171—2003
在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，可根据SOD抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD活力。4试剂
4.1A液：pH8.200.1mol/L.三羟甲基氮基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（内含1mmol/LEDTA·2Na）。称取1.2114gTris和37.2mgEDTA·2Na溶于62.4mL0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馅水定容至100mL.
4.2B液：4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚（A.R）56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，并定容至100mL。
4.310mmol/L盐酸溶液。
4.40.200mg/mL超氧化歧化酶（SOD)。4.5蒸馅水：二重石英蒸馏水。
5仪器
5.1紫外-可见分光光度计。
5.2精密酸度计，精确度0.01pH。5.3离心机。
5.410mL比色管。
5.510mL离心管。
玻璃乳钵。
6试样的制备
6.1固体样品（茶、花粉等）称取1.00g样品置于玻璃乳钵中，加人9.0mL蒸馏水研磨5min，移人10mL离心管。用少量蒸馏水冲洗乳钵，洗涤并入离心管中，加蒸馏水至刻度，经4000r/min离心15min，取上清液测定。
6.2澄清液体样品可取原液直接测定，浑浊液体样品经4000r/min离心15min，再取上清液测定。413
GB/T 5009.171—2003
7分析步骤
7.1邻苯三酚自氧化速率测定在25℃左右，于10mL比色管中依次加人A液2.35mL，蒸馅水2.00ml,B液0.15mL。加人B液立即混合并倾人比色ⅢL，分别测定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率△Azzs（min-\）。本试验确定△A32s（min-1)为0.060。7.2样液和SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按7.1步骤分别加人一定量样液或酶液使抑制邻苯三酚自氧化速率约为1/2AAs25（min-1)，即△A325（min\1）为0.030。SOD活性测定加样程序见表1。
表1SOD活性测定加样表
A液/mL
蒸馏水/ml
样液或SOD液/μL
B液/mL
8结果
8.1结果计算
8.1.1液体样品按式（1)计算：
AA325-AA's25×100%
SOD活力（U/mL）=
式中：
SOD酶活力单位；
邻苯三酚自氧化速率；
-样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率；V—-所加酶液或样液体积，单位为毫升(mL)；D——酶液或样液的稀释倍数；
4.5—一反应液总体积，单位为毫升（mL）。计算结果保留三位有效数字。
8.1.2固体样品按式（2)计算：
SOD活力（U/g）
式中：
AA'325
AAs =AA'an ×100%
一加人酶液或样液体积，单位为竞升（mL)；邻苯三酚自氧化速率；
一样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率；一酶液或样液的稀释倍数；
V,一样液总体积，单位为毫升（mL）：m
一样品质量，单位为克（g）；
4.5一一反应液总体积，单位为毫升（mlL）。计算结果保留三位有效数字。
8.2精密度
SOD液
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。414
9定义
第二法化学发光法
在分析条件下抑制50%发光强度时所需的SOD量为一个活力单位。10原理
SOD能够催化下述反应：
O:-+O:+2H+SOPH,O.+0
GB/T 5009.171—2003
在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶可催化黄嘌呤（或次黄嘌呤）氧化转变成尿酸，在该反应过程中同时产生O。O2可与鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼）进一步作用，使发光剂米诺被激发，而当其重新回到基态时，则向外发光。由于SOD可消除O；-，所以能抑制米诺的发光。通过该反应过程，以空白对照的发光强度值为100%，通过加入SOD后抑制发光的程度进行SOD活性的测定。11试剂
11.10.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2)11.1.10.1mol/L碳酸钠(NazCO,)溶液称取碳酸钠（A.R)10.599g用蒸馏水溶解并定容至1000mL。11.1.20.1mol/L碳酸氢钠（NaHCO，）溶液称取碳酸氢钠（A.R)8.401g用蒸馏水溶解并定容至1000mL.
11.1.30.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10.2）将0.1mol/L碳酸钠（NazCO,）溶液和0.1mol/L碳酸氢钠(NaHCO.）溶液按6+4比例混合。11.1.40.05mo1/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10.2）0.1mol/LpH10.2碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（11.1.3)与蒸馏水按1+1比例混合。11.20.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠（内含0.1mmol/LEDTA2Na）绶冲液（pH10.2）称取37.2mgEDTA·2Na用0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠pH10.2缓冲液（11.1.4）溶解并定容至1000mL。11.30.1mmol/L智米诺溶液（Luminol）称取3.54mg鲁米诺用蒸馏水溶解并定容至200mL。11.40.1mmol/L次黄嘌岭溶液（HX）称取2.76mgHX用蒸馅水溶解并定容至200mL。11.50.1mmol/L黄呤氧化酶（XO）0.1mgXO用含0.1mmol/LEDTA·2Na的0.05mol/L碳酸盐缓冲液(11.2)定容至1.0mL。11.60.001mg/mL超氧化物歧化酶（SOD）精密称取0.1mgSOD用含0.1mmol/LEDTA.2Na的0.05mol/L碳酸盐缓冲液（11.2)定容至100mL。11.7HX-L液0.1mmol/LHX溶液与0.1mmol/L鲁米诺溶液1+1(V/V)混合（临用时混合）12仪器
生物化学发光仪。
13试样的制备
按第一法中第6章规定的方法操作。只是固体样品用0.05mol/L.碳酸钠-碳酸氢钠（内含0.1mmol/LEDTA·2Na)缓冲液（11.2)代替蒸增水。14分析步骤
14.1绘制抑制发光曲线
操作程序见表2和图1。
GB/T5009.171—2003
[SOD]/(ng /mL)
图1SOD抑制化学发光曲线
表2SOD抑制化学发光曲线制作步骤0（对照）
0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓净液（pH10.2)/μL0.1mg/mLXO/μL
HX-L液/μL
不同浓度SOD（或试液)/μuL
SOD浓度/（ng/mL)或（样液体积/μL）相对光强
未抑制/%
抑制/%
14.2测定SOD活性
测定样品相对发光强度，计算抑制发光率，并查SOD抑制发光曲线，得SOD量（ng）。15结果
15.1结果计算
15.1.1液体样品按式(1)计算：
SOD活力(U/mL）=m×10×3.5×3300Vxcso
式中：
查抑制曲线中SOD量，单位为纳克(ng)；一取样液体积，单位为毫升（mL）；XD
标准SOD抑制50%发光时的SOD浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml.）；SOD标准比活力U/mg蛋白；
-SOD酶液抑制50%化学发光率时的SOD浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；样液的稀释倍数。
计算结果保留三位有效数字。
15.1.2固体样品按式（2）计算：SOD活力(U/g）×10×V×3.5×3300mXV.Xc5o
式中：
查抑制曲线中SOD量，单位为纳克（ng)；样品质量，单位为克（g）；
样液总体积，单位为毫升（mL）：XD
（2）
V,-取样液体积，单位为毫升（mL）：GB/T5009.171—2003
3.5—标准SOD抑制50%发光时的SOD浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；3300--SOD标准比活力U/mg蛋白；Cso-—SOD酶液抑制50%化学发光率时的SOD浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；D—样液的稀释倍数。
计算结果保留三位有效数字。
15.2精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。417
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