【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 空肠弯曲菌检验

ICS07.100.30
中华人民共和国国家标准
GB/T4789.9—2003
代替GB/T4789.9—1994
食品卫生微生物学检验
空肠弯曲菌检验
Microbiological examination of food hygieneExamination of Campylobacter jejuni2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
GB/T4789.9-—2003
本标准对GB/T4789.9—1994《食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验》进行修订。本标准与GB/T4789.9-1994相比主要修改如下：按GB/T1.1一2000对标准文本的格式和文字进行修改。-修改并规范原标准中的“设备和材料”。本标准自实施之日起，GB/T4789.9-1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国进出口商品检验技术研究所、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：孟洪德、冉陆、付萍、姚景会。本标准于1984年首次发布，1994年第一次修订，本次为第二次修订。60
1范围
食品卫生微生物学检验
空肠弯曲菌检验
本标准规定了空肠弯曲菌的检验方法。本标准适用于各类食品和食物中毒样品中空肠弯曲菌的检验。2规范性引用文件
GB/T4789.9—2003
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28—2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料
3.1冰箱：0℃~4℃。
恒温培养箱：42℃±1℃、36℃±1℃、25℃土1℃。3.2
3.3恒温水浴锅：37℃士1℃。
3.4显微镜：10×~100×。
3.5相差显微镜。
3.6离心机：3000r/min。
均质器或灭菌乳钵。
厌氧罐：带有双相压力表。
3.9液氮罐。
3.10气袋。
灭菌厚壁毛细管。
灭菌培养Ⅲ：直径90mm。
灭菌锥形瓶：500mL。
灭菌刀、剪子、镊子等。
4培养基和试剂
蛋白陈水：按GB/T4789.28-2003中3.13规定。4.1
4.2Cary-Blair氏运送培养基：按GB/T4789.28—2003中4.52规定。4.3改良Camp-BAP培养基：按GB/T4789.28—2003中4.53规定。4.4Skirrow氏培养基：按GB/T4789.28—2003中4.54规定。4.5氧化酶试剂：按GB/T4789.28—2003中3.18规定。4.63%过氧化氢液：按GB/T4789.28-2003中3.20规定。4.71%甘氨酸培养基：按GB/T4789.28-2003中4.56规定。4.830μg萘啶酸圆形滤纸片。
4.9三糖铁培养基：按GB/T4789.28—2003中4.26规定。4.10革兰氏染色液：按GB/T4789.28—2003中2.2规定。61
GB/T4789.9-—2003
TTC琼脂：按GB/T4789.28—2003中4.55规定。马尿酸钠培养基：按GB/T4789.28—2003中3.9规定。4.12
三氟化铁：按GB/T4789.28-2003中3.9规定。快速硫化氢（HzS)试验琼脂：按GB/T4789.28—2003中4.50规定。4.14
5DNA酶甲基绿琼脂：按GB/T4789.28—2003中4.51规定。4.15
5检验程序
空肠弯曲菌检验程序见图1。
改良Camp-BAP
布氏杆菌培养基
42℃48h，微需氧
6操作步骤免费标准bzxz.net
血清分型
6.1样品的采集及处理
血琼股平板
42℃,48h，微需氧
生物分型
食物样品采集后应尽快进行检验。如果样品必须运送和保存，应使用Cary-Blair半固体培养基。弯曲菌的存活时间取决于温度，在25℃情况下，其存活时间不到24h或更短，因此样品在原始分离前需62
放冰箱或冷处保存。
6.2微需氧条件的制备
最佳微需氧条件是氧气为5%、二氧化碳为10%、氮气为85%。GB/T4789.9--2003
6.2.1带有双相压力计（可表示正负压的）厌氧罐：在装Ⅲ密封后，先抽去罐内空气至负压7.3×10\Pa（550mmHg）处，输人上述三种混合气体使罐内压力恢复于零；再将罐内气体抽至负压7.3×10*Pa（550mmHg）同样输入上述气体至零，即可放置温箱培养。6.2.2气袋法：操作时只使用气体发生剂而不加催化剂。6.2.3双平板法：取两块平板，一块平板接种已知的兼性厌氧菌（如变形杆菌），另一块平板接种样品，去掉皿盖，将含琼脂的两只Ⅲ相对合齐并用胶布粘封，放入密封不气的罐内（或袋内）进行培养。由于兼性厌氧菌生长的代谢作用，可使小环境中的氧气浓度下降和二氧化碳浓度上升。6.2.4蜡烛缸法：将已接种细菌的平板置于容量2000mL的磨口标本缸或干燥器内。缸盖及缸口涂以凡士林，放人小段点燃蜡烛于缸内（勿靠近缸壁，以免烤热缸壁而炸裂），盖密缸盖。缸内燃烛约0.5min~1min，因氧减少自行熄灭，此时容器内约含二氧化碳5%～10%。最后连同容器一并置于42℃土1℃温箱中培养。
6.3分离培养
6.3.1拭子或液体可直接在选择性培养基如改良Camp-BAP布氏杆菌培养基或使用Skirrow氏培养基平板上划线接种。于42℃培养48h后，观察可疑菌落。6.3.2第一型菌落不溶血，灰色、扁平、湿润、有光泽，看上去像水滴，有从接种线向外扩散的倾向，第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的单个菌落（直径为1mm2mm），边缘完整、发亮。6.4初步鉴定
将可疑菌落做氧化酶和过氧化氢酶试验，如为阳性，则涂片做革兰氏染色。本菌为革兰氏阴性菌，大小为（0.3μm~0.4μm）×（1.5μm3μm），呈S形、螺旋状或纺锤形。在固体培养基上培养时间过久或在不适条件下则常呈现球形菌。在暗视野或相差显微镜下观察，动力明显。根据菌落生长特征、菌体染色、动力、氧化酶和过氧化氢酶试验阳性者，可初步确定为弯曲菌。6.5确定鉴定
经初步鉴定后，仍需做下述试验（以下各项试验均需在5%氧气的微需氧环境中培养）。6.5.1甘氨酸耐受性试验：接种于甘氨酸培养基中，培养48h，如为阳性、在培养基表面有云雾状生长，则为弯曲菌空肠亚种。
6.5.2硫化氢生长试验：接种于TSI斜面上，并吊一根乙酸铅滤纸条于管口，培养物经48h72h培养，空肠弯曲菌一般在斜面上少量生长，其反应为碱性/碱性（K/K），滤纸条变黑，但培养基底部不因硫化氢而变黑。
6.5.3对3.5%氯化钠的耐受性试验：接种于3.5%含盐肉汤培养基，经48h培养，空肠弯曲菌不生长。
6.5.442℃和25℃生长试验：将培养物接种于两管布氏肉汤中，一管放于42℃，一管放于25℃培养48h，42℃生长而25℃不生长者，则为空肠弯曲菌。6.5.5马尿酸钠水解试验：将培养物接种于马尿酸钠培养基，于42℃培养48h，离心沉淀取出部分上清液。加入三氮化铁试剂，如出现恒久沉淀物则为阳性，空肠弯曲菌呈阳性反应。6.5.6萘啶酸试验：将可疑空肠弯曲菌涂布接种于血平板上，然后贴上含30μg萘啶酸的滤纸于平板上，空肠弯曲菌敏感而肠道弯曲菌不敏感。6.5.7TTC2,3,5-氯化兰苯四氮唑）试验：空肠弯曲菌在TTC培养基上呈阳性，而胎儿弯曲菌为阴性，阳性者为紫色菌苔并有光泽。6.5.8硝酸盐还原试验：取培养物的浓菌悬液，在37℃放置2h，加入试剂，观察颜色反应，空肠弯曲菌呈红色的阳性反应。
GB/T4789.9—-2003
弯曲菌的生化鉴别见表1。
表1弯曲菌属各个种的生化性状
过氧化氢酶
氧化酶
1%甘氨酸试验
硫化氢试验(纸条法)
3.5%氯化钠耐受试验
25℃生长试验
42℃生长试验
硝酸盐还原试验
萘啶酸试验
TTC试验
马尿酸钠水解
胎儿亚种
胎儿弯曲菌
结肠亚种
空肠亚种
痰弯曲菌
痰亚种
牛亚种
注：+90%和90%以上阳性；d有的阴性，有的阳性；（一）一般不生长；一90%和90%以上阴性；？未知。6.6生物分型
粪弯曲菌
6.6.1快速马尿酸钠水解试验：将细菌接种在1%马尿酸钠0.4mL，37℃水浴2h，再加丙酮与丁酮溶液的3.5%节三酮0.2mL，徐徐加人避免相混，放置10min后观察结果。深紫色为阳性，淡紫色或无色为阴性。
6.6.2快速硫化氢（HS)试验：取一环细菌悬浮于快速硫化氢半固体琼脂上三分之一段，37℃水浴2h，观察结果，细菌团块周围变黑为阳性。6.6.3DNA酶水解试验：细菌点种于DNA酶甲基绿琼脂平板上，微需氧环境培养3d～5d，菌苔周围出现无色透明环为阳性。生物分型结果见表2。表2空肠弯曲菌等的生物分型
快速马尿酸钠试验
快速硫化氧试验
DNA酶水解
6.7血清分型
空肠弯曲菌
李曲菌
空肠弯曲O因子分型应采用间接血凝法，H或K因子分型可用玻片凝集法。6.8菌种保存
嗜热弯曲菌
空肠弯曲菌菌种应接种在改良Camp-BAP斜面培养基上（棉塞不宜过紧），于42℃～43℃微需氧中培养48h后，置4℃冰箱微需氧内可保存10d~14d，需要时仍可转种一次，长期保存用冻干法。6.9注意事项
对空肠弯曲菌检验时，应严格执行无菌操作，防止自身感染。64
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