【其他行业标准】 钩虫检测及虫种鉴定标准 钩蚴培养法

ICS 11.020
CCS C 61
中华人民共和国卫生行业标准
WS/T 791—2021
钩虫检测及虫种鉴定标准钩呦培养法Detection and identification standard of hookworm-Hookworm larvae coproculture techniques2021—11—23 发布
2022—05—01实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会　发布前言
WS/T791—2021
本标准由国家卫生健康标准委员会寄生虫病标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，由中国疾病预防控制中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委疾病预防控制局负责业务管理、法规司负责统筹管理。
本标准起草单位：河南省疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、浙江省疾病预防控制中心。
本标准主要起草人：许汴利、邓艳、郑彬、陈伟奇、张雅兰、陈颖丹、阮卫、张红卫。1范围
钩虫检测及虫种鉴定标准钩培养法本标准规定了钩坳培养法对十二指肠钩口线虫和美洲板口线虫进行检测的方法。本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对钩虫的检测和虫种鉴定。2规范性引用文件
WS/T791—2021
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
WS233病原微生物实验室生物安全通用准则WS/T439钩虫病的诊断
3术语和定义
WS/T439界定的以及下列术语和定义适用于本标准。3.1
十二指肠钩口线虫Ancylostomaduodenale十二指肠钩虫
属于钩口科、钩口线虫属，我国主要分布于北方地区3.2
美洲板口线虫Necatoramericanus美洲钩虫
属于钩口科、板口线虫属，我国主要分布于南方地区3.3
钩呦hookwormlarvae
钩虫的幼虫。
注：分为杆状坳和丝状蝴两个阶段，丝状坳为感染阶段幼虫，其形态特征有助于虫种鉴定。1
4仪器设备
4.1生物显微镜（物镜10倍、40倍，目镜10倍）。4.2培养箱（隔水式恒温）。
目镜测微尺（5mm/50/0.1mm）和物镜测微尺（1mm/100/0.01mm）。4.3
5试剂或材料
5.1试管（12.0cm×1.5cm）或15mL离心管。5.2
滤纸条（12cm×2cm），边缘整齐、无毛边，对孔径、流速无要求。5.3
蒸馏水。
5.4　试管架。
载玻片（76mm×26mm）。
盖玻片（20mm×20mm)。
吸管（2mL、10mL），
5.8镊子。
5.9刮棒（加藤板配套刮棒适用）。5.10温度计。
6检测步骤
6.1样本采集
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取5g～10g新鲜粪便置于粪便采样盒或采样袋内，标记待检样本编号、采集日期，样本应及时送检。如未能及时检测，在4℃～8℃条件下冷藏保存，时间应不超过24h。6.2样本检测
6.2.1在试管上标注待检样本编号和日期。6.2.2试管内加入室温蒸馏水约2mL。6.2.3将滤纸条沿长轴对折，以保持挺直。6.2.4用刮棒取0.3g～0.5g粪便，均匀涂抹于滤纸中段偏上部，左右各留约0.5cm，上端留约1cm，下端留约2.5cm空白（见附录A）。6.2.5将涂有粪便的滤纸插入试管，滤纸插入水中的深度以粪膜下缘距水面上1cm为宜（见附录A）。2
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6.2.6将试管置于培养箱内，31℃培养4d，或室温26℃～30℃培养6d～8d。培养期间每日观察管底水量，必要时沿管壁加蒸馏水以保持原始液面高度，防止干燥。6.2.7分离幼虫：取出试管，沿管壁加入45℃蒸馏水，淹没滤纸上的粪膜，1h后用镊子取出滤纸条，弃去。将培养管置于试管架上静置1h，吸去上清液，留取约0.5mL沉淀液。6.3镜下观察
将试管底部浸于50℃～60℃的热水内制动2min～3min。吸取管内沉淀物1滴～3滴于载玻片上，加盖玻片，将载玻片置于低倍镜下（10×10）弱光检查，发现疑似虫体后置于高倍镜下（40×10）观察形态结构，用测微尺测量幼虫大小。6.4结果判定
若一份样本所有沉淀物中均未检出钩蝴，判为阴性；若检出钩蝴，判为阳性。根据丝状蝴形态特征进行十二指肠钩虫和美洲钩虫的鉴定（见附录B），并与其他土源性线虫丝状蜥进行鉴别（见附录C）。6.5废弃物处置
实验中所有材料应按照WS233进行处理。3
附录A
（资料性）
钩坳培养法操作示意图
钩坳培养法操作可参照图A.1和图A.2。取0.3g~0.5g粪便
均匀涂抹
图A.1粪样涂抹示意图
编号和日期
放大图
蒸馏大
图A.2滤纸条及离心管位置示意图放大图
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附录B
（资料性）
十二指肠钩虫与美洲钩虫丝状坳的鉴别WS/T 791—2021
钩蝴分为杆状蜘和丝状蜘两个阶段，自卵内刚孵出的幼虫为杆状，杆状蝴经过两期发育成为丝状蜘，长约0.5mm～0.7mm，体表覆有鞘膜，口腔封闭，在与食管连接处有2个角质状的矛状结构，称口矛。此期幼虫形态特征明显，两种钩虫丝状坳的鉴别要点见表B.1、图B.1。十二指肠钩虫与美洲钩虫丝状坳的鉴别要点表B.1
鉴别要点
头端形态
鞘膜横纹
食管与肠连接处
生殖原基
十二指肠钩虫丝状蛾
细长，自头至肛门宽度相近
难见到或细、短
扁平，中间微有凹陷
不显著
呈微细颗粒状横带
管腔较窄，肠细胞颗粒丰富
肠管中部稍后
美洲钩虫丝状蜘
粗短，自食管基部起渐次缩小
较易见到，呈暗色杆状
圆形，无凹陷
透明状横带
管腔较宽，肠细胞颗粒少
肠管中部稍前
头端一bzxz.net
食管与肠连接处
生殖原基
十二指肠钩虫丝状蝴
美洲钩虫丝状蝴
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鞘膜横纹
图B.1十二指肠钩虫及美洲钩虫丝状形态示意图（仿WHO）6
附录C
(资料性）
钩虫与其他土源性线虫丝状蝴的鉴别WS/T791—2021
钩虫与类圆线虫属（Strongyloides）、毛圆线虫属（Trichostrongylus）、结节线虫属（Oesophagostomum）等丝状可通过鞘的有无、食管占体长比例、肠管腔直或弯曲、虫体尾端形态等特征进行虫种鉴别，主要鉴别要点见表c.1，图c.1。
钩虫、粪类圆线虫和东方毛圆线虫丝状坳的形态鉴别鉴别点
体长（mm）
生殖原基
为体长的1/5
在虫体的中部
粪类圆线虫
为体长的1/2，咽管球不明显
在虫体后部
东方毛圆线虫
为体长的1/4
有小球状物
1.观察有无鞘和食道占体长比例无鞘，食道长，占体长的2/5或1/2，尾部有凹陷
2.观察肠管腔形态
（类圆线虫属）
3a.观察口矛和鞘膜横纹
低倍镜下
食道矛明显
高倍镜下
鞘膜横纹明显
(美洲钩虫）
肠管腔直（钩虫)
食道矛不明显
鞘膜横纹不明显
有鞘，食道短，占体长的1/4
肠管腔弯曲
3b.观察鞘后端形态
鞘后端较长
4.观察括约肌细胞
食道与肠管间有一对
细长的括约肌细胞
（十二指肠钩虫）（缩小三齿线虫）WS/T791—2021
鞘后端较短
（毛圆线虫属）
无一对括约肌细胞
（结节线虫属）
图C.1土源性线虫丝状检索图（仿余森海，1992.）8
参考文献
吴观陵．人体寄生虫学.4版．北京：人民卫生出版社，2013.许隆祺．图说寄生虫学与寄生虫病．北京：北京科学技术出版社，2016薛纯良，许隆祺．寄生虫病诊断与治疗．长沙：湖南科技出版社，2002.余森海，许隆祺．人体寄生虫学彩色图谱．北京：中国科学技术出版社，1992诸欣平，苏川．人体寄生虫学.9版北京：人民卫生出版社，2018WS/T 791—2021
Harada Y, Mori O.Anew method for culturing hookworm.Yonago Acta Med.1955, 1:177-179Kitvatanachai S, Taylor A, Rhongbutsri P, et al. Modified Harada-Mori and simple wet mount todetermine hookworm infections in Yo Island urban area, Songkhla, Southern Thailand. Trop Med Health.2019, 47(27):1-5.
[8] Martin-Rabadan P, Munioz P, Palomo J, et al. Strongyloidiasis: the Harada---Mori test revisited. ClinMicrobiolInfect.1999,5(6):374-376[9] Report of a WHO Scientific Group. World Health Organization Technical Report Series 666:Infestinalprofozoan and helminthic infections. World Organisation for Animal Health and World HealthOrganization.1981.