【国家标准】 贝类包纳米虫病诊断方法

ICS65.020.30
CCS B 41
中华人民共和国国家标准
GB/T42821—2023
贝类包纳米虫病诊断方法
Diagnostic methods for bonamiosis of molluscs2023-08-06发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-03-01实施
规范性引用文件
术语与定义
缩略语
试剂和材料
器材和设备
临床症状
组织印片检查
组织病理检查
PCR检测
荧光PCR检测
13综合判定
附录A（规范性）
附录B（资料性）
附录（（资料性）
组织印片、组织病理检查及DNA提取相关溶液配制贝类包纳米虫病
日标扩增序列及引物、探针的位置GB/T42821—2023
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则起草。
GB/T42821—2023
第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、广州海关。
本文件主要起草人：吴绍强、王彩霞、白昌明、李清、邓艳、冯春燕、王崇明、阴鸿达、袁向芬、许晓琳、柏建山。
1范围
贝类包纳米虫病诊断方法
GB/T42821—2023
本文件给山了贝类包纳米虫病（honamiosis）诊断的缩略语、试剂和材料、器材和设备，描述了临床症状、采样、组织印片检查、组织病理检查、PCR检测、荧光PC'R检测利综合判定的方法。本文件适用于牡蛎包纳米虫（Bonamiaostree）和杀蛎包纳米虫（Bonamiae.ritiosa）引起的贝类包纳米虫病的流行病学调查、诊断、检疫和监测2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注目期的引用文件.其最新版本（包括所有的修改单)适川于本文件。
GB/T6682
分析实验室用水规格和试验方法出人境动物检疫采样
GB/T18088
GB/T19495.2
术语与定义
」实验室技术要求
转基因产品检测
本文件没有需要界定的术语和定义。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp：碱基对(basepair）
Ct：扩增循环数（cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸混合物（deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediamineteiraaceticacid）FAM：羧基荧光素（carlhoxyfluorescein）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）SDS：十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate）Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus）TE：Tris盐酸和EDTA缓冲溶液（EDTATris·HCI)Tris：三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymeihylaminomethane）试剂和材料
本文件中所有化学试剂.除非另有规定.仅使用分析纯试剂。1
GB/T42821—2023
水：符合GB/T6682中规定的一级水。丙酮：常温保存。
中醇：常温保存。
无水乙醇：常温保存。
生理盐水（0.9%）：常温保存。10XPCR缓冲液（无Mg+）：一20℃保存。MgClz溶液（25mmol/L）：一20℃保存。dNTPs（A、T、G、C四种碱基各2.5mmol/I）：一20℃保存。TaDNA聚合酶（5U/μl.）：-20℃保存。姬姆萨染液、戴维森氏固定液：按附录A中A.1利A.2配制。蛋白酶K（20mg/ml.）：按A.3配制。10%SDS：按A.4配制。
乙酸铵（10mol/L）：按A.5配制，酚/三氮甲烷/异戊醇混合液：配制比例25：24：1。乙醇溶液（75%）：按A.6配制。TE缓冲液：按A.7配制。
1X电泳缓冲液：按A.9配制。
阳性对照：已知感染包纳米虫的贝类组织样品，一80℃保存。阴性对照：已知未感染包纳米虫的贝类组织样品，一80℃保存。空白对照：双蒸水。
引物BonF:5'-CATTTAATTGGTCGGGCCGC-3'（10mol/L).-20℃保存。引物BonR：5'-CTGATCGTCTTCGATCCCCC-3'(10umol/L).-20℃保存。引物BonqF：5'-GAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAAC-3'（10umol/L），-20℃保存。引物BonqR：5'-CATAAGTTAGTCTCACCGGAATTAAAG-3'（10umol/L).-20℃保存。探针Bon qP:5'-FAM-TCTGGCCCGGCGATACTAGCACCC-Eclipse-3'（10μmol/1.),-20℃保存。
琼脂糖：电泳级。
核酸染料：4℃保存。
6×上样缓冲液：一20℃保存
DNA分子质量标准溶液：一20℃保存。苏木精染液、伊红染液、返蓝液：按A.10～A.12配制。载玻片。
器材和设备
组织切片机。
显微镜。
4℃冰箱。
一20℃冰箱。
-80℃冰箱。
勾浆研磨器。
冷冻高速离心机。
二级生物安全柜。
6.9普通PCR仪。
荧光PCR仪。
水平电泳仪。
凝胶成像仪。
水浴锅。
微量移液器。
电子天平。
临床症状
患病贝类双壳闭合不全，严重时死亡，轻则尤明显症状.见附录3。8采样
采样对象
优先采集2龄及以上濒死的贝类。8.2
2采样部位
成贝取血淋巴、鳃、心脏。幼贝、稚贝内脏团8.3采集数量
GB/T42821—2023
临床无症状贝类样品每个批次采集150个以上，临床有症状贝类样品每个批次采集30个以上。进口贝类样品的采样数量应符合GB/T18088的规定。8.4
保存及运送
取样应加贴标签，标签上清楚标明样品编号、采样时间、采样地点、采样人员和养殖背景，样品应24h内冷链送达实验室，立即检测或保存于一80℃冰箱待检。9
组织印片检查
9.1制片、染色与观察
将鳃或心脏组织用吸水纸吸去多余水分后，用镊子将组织在载玻片上轻轻挤压涂片：使其形成薄层膜：白然晾干，丙酮或甲醇固定1min.滴加姬姆萨染液4滴～5滴，染色5min～10min.流水冲洗，晾干后置于400倍～1000倍显微镜下观察。9.2结果判定
印片组织中发现虫体判为阳性。虫体呈球形或卵圆形，大小为2um～5um。虫体细胞质呈浅蓝色，细胞核呈红色。常见干而细胞内感染严重时.血细胞外也可观察到虫体。染色后虫体形态见图B.1和图B.210
组织病理检查
10.1样品定
用戴维森民固定液固定样品，固定液与组织块的体积比为（15：1）～（20：1）.固定24h～48h。3
GB/T42821-2023
10.2石蜡切片制备、染色与观察按A.13的要求采用组织切片机制备石蜡切片，封片后置于400倍～1000倍显微镜下观察。10.3结果判定bZxz.net
切片组织中发现虫体即判为阳性。虫体呈球形或卵圆形，大小为2um～5um。虫体细胞质呈浅蓝色，细胞核呈红色，常见于血细胞内，感染严重时.血细胞外也可观察到虫体。染色后虫体形态见图B.3。11PCR检测
11.1实验室技术要求
检测实验室的分区要求、质量控制和质量保证应符合GB/T19495.2的规定。11.2操作步骤
11.2.1DNA提取
11.2.1.1利用电子天平称取30mg~50mg组织样品.置于0℃~4℃的生理盐水（4℃冰箱预冷）中反复冲洗，滤纸吸干表面水分后置于勾浆研磨器中并加人0℃～4℃（4℃冰箱预冷）的生理盐水，充分匀浆研磨。提取过程同附设置阳性对照、阴性对照和空白对照。11.2.1.2加入2.5ul.20mg/ml.蛋白酶K至终浓度100μg/ml..再加10%SI)S至终浓度为1%（质量分数）.上下颠倒混匀后置于50℃水浴锅水浴3h，不时旋动。11.2.1.3向匀浆液中按1：1体积比加人酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1），轻轻震荡混匀5min，置于冷冻高速离心机中.12000r/min离心5min。11.2.1.4吸取上层水相转移至新的1.5mL灭菌离心管中，加人等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min.置于冷冻高速离心机中，12000r/min离心5min。11.2.1.5吸取上层水相转移至新的1.5ml.灭菌离心管中，加人100ul.10mol/L乙酸铵，混匀后，再加人两倍体积预冷无水乙醇（一20℃冰箱预冷）混匀.置于一20℃冰箱放置2h。11.2.1.6采用冷冻高速离心机12000r/min离心10min，沉淀DNA，倾去上清液11.2.1.7向沉淀中加人75%乙醇溶液500ul.，轻轻混匀后采用冷冻高速离心机12000r/min离心5min，倾去上清液，室温晾干。向IDNA沉淀中加TE缓冲液100L溶解。一20℃冰箱保存备用。11.2.1.8
11.2.1.9可采用同等抽提效果的其他方法或商品化DNA提试剂盒。11.2.2反应体系
在二级生物安全柜中用微量移液器向PCR管内加入10×PCR缓冲液（无Mg2+）2.5uL、MgCl2溶液（25mmol/I.)2.0μl、5U/ul.TaqDNA聚合酶0.5ul、10umol/I引物BonF和引物BonR各1.0μl、dNTPs（各2.5mmol/1.)2.0l，加入模板DNA2.0ul，补充双蒸水至25.0μL。11.2.3扩增程序
利用普通PCR仪进行PCR扩增.设置扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性1min.55℃退火1min，72℃延伸1min.35个循环；72℃延伸10min，4℃保温。4
11.2.4琼脂糖电泳
GB/T42821—2023
配制1%～2%的琼脂糖凝胶并加入核酸染料，待胶凝固后置于含有1×电泳缓冲液的水平电泳仪中，取5uI.PCR扩增产物与1L6×上样缓冲液混匀后加入加样孔中，同时取5LDNA分子质量标准溶液加入加样孔中，进行电泳，电泳结束.在凝胶成像仪下观察。11.3结果判定
检测成立的条件
阳性对照在300bp处有扩增条带，阴性对照300bp处无扩增条带，空白对照无任何条带.检测有效。
11.3.2PCR检测结果判定
若待检样品在300bp处无条带.则判为PCR检测核酸阴性若待检样品在300bp处有条带.则判为PCR检测核酸阳性。11.3.3序列分析及包纳米虫种类鉴定对PCR检测为核酸阳性的样品PCR产物进行测序，测序结果同参考序列比对分析（见附录C中C.1、C.2），若序列中同时存在HaeⅡ和Bg!I两个切位点（见.1），可判定样品为Bonumiuostreue核酸阳性。若序列中只存在Hae《酶切位点（见（.2），则判定样品为Bonamiae.ritiosa核酸阳性。12荧光PCR检测
12.1实验室技术要求
检测实验室的分区要求、质量控制和质量保证应符合GI3/T19495.2的规定。12.2操作步骤
DNA提取
按11.2.1规定执行。
12.2.2反应体系
在二级生物安全柜中用微量移液器向PCR管内加人10×PCR缓冲液（无Mg21）2.5ul.、MgCl2溶液（25mmol/L)2.0μlL、5U/μlTaqDNA聚合酶0.5l.、10mol/l.引物BonqF和引物BonqR各1.0ul、10uμmol/I探针BonαP0.5μl.、dNTPs（各2.5mmol/1.)2.0ul.加人模板DNA2.0μL.补充双蒸水至25.0uL。
12.2.3扩增程序
利用荧光PCR仪进行荧光PCR扩增反应，设置扩增程序如下：95℃预变性4min；95℃变性15s.55℃退火30S.45个循环.每个循环结束后采集荧光数据。12.3结果判定
检测成立条件
阳性对照Ct值≤35，且出现特异性扩增曲线；阴性对照无（Ct值或者（t值>40且无特异性扩增邮5
GB/T42821—2023
线.检测有效，否则应重新进行检测。2荧光PCR检测结果判定
若样品Ct值≤35，则判定荧光PCR检测核酸阳性。若样品无扩增曲线或者（Ct值>40，则判定荧光PCR检测核酸阴性。若3540，则判为荧光PCR检测核酸阴性（荧光PCR扩增序列及引物、探针的位置见C.3）。13
综合判定
疑似判定
贝类组织通过组织印片检查、组织病理检查、PCR检测、荧光PCR检测.其中任一种检测结果为阳性，则判定为疑似包纳米虫病。13.2确诊判定
已知贝类包纳米虫病流行区内的贝类样品13.2.1
组织印片检查和组织病理检查一种或两种方法检测为阳性，且PCR检测或者荧光PCR检测为阳性的.则确诊为贝类包纳米虫病。13.2.2
已知贝类包纳米虫病流行区外的贝类样品组织印片检查和组织病理检查一种或两种方法检测为阳性，且PCR检测或者荧光PCR检测为阳性的，需将样品送至参考实验室进行最后的确诊。6
A.1姬姆萨染液
附录A
（规范性）
组织印片、组织病理检查及I)NA提取相关溶液配制GB/T42821-2023
贮存液：称最姬姆萨粉0.5、甘油33m1.、甲醇33mL。先将姬姆萨粉研细，再逐滴加入片油，继续研磨最后加人甲醇.在56℃放置24h或者室温放置3d～5d后即可使用。A.1.2工作液：取贮存液采用蒸馏水10倍稀释即可.临用时配制。A.2
戴维森氏固定液
95%乙醇
37%甲醛
冰乙酸
混匀，室温密封贮存。
20mg/ml.蛋白酶K
蛋白酶K
溶解后分装于1.5ml.离心管中（0.25ml./管），一20℃下保存。A.4
10%SDS
加热至68℃助溶，加人儿滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2，加水定容至100mI.。室温贮存。若溶液有结品形成.用前加热溶解即可。SDS微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和电子天平上的SDS。
10mol/l.乙酸铵
乙酸铵
加水定容至100ml.，经0.22μm滤膜过滤除菌。4℃贮存。A.6
75%乙醇
无水乙醇
加水25ml.混匀.定容至
分装后，室温贮存。
TE缓冲液（pH8.0）
1mol/1.Tris·HCl(pH8.0)
GB/T42821—2023
0.5mol/I.EDTA(pH8.0)
加水定容至
高压蒸汽火菌，4℃贮存。
50×电泳缓冲液
冰乙酸
0.5mol/I.EDTA(pH8.0)
川水定容至
室温贮存。
1×电泳缓冲液
50×电泳缓冲液
加水定容至
室温贮存。
苏木精染液的配制方法
苏木精
无水乙醇
硫酸铝钾
蒸馏水
氧化汞
冰乙酸
1000ml
分别用无水乙醇溶解苏木精，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加人氧化汞.继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即用冰水冷却.恢复至室温后过滤备用。A.11
伊红染液的配制
选用水溶性伊红。配方为：伊红1g、70%～75%酒精100mL、伊红用少许蒸馏水调成糊状，再加入酒精.边加边搅拌，直至彻底溶解.此时试剂有些浑浊，取0.1mL冰乙酸，加人试剂中.试剂逐渐转变为清亮.呈鲜红色。
返蓝液的配制
取5mL氢氧化氨.加人1000ml.蒸馏水中即可。A.13
石蜡切片制备
A.13.1组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片取材固定24h.修整组织块.换固定液重新固定12h.自来水冲洗24h、70%乙醇1h、85%乙醇1h、95%乙醇45min2次，无水乙醇30min3次.二甲苯30min，二甲苯5min~20min2次，放人石蜡1h1.5h2次.然后包理，并修片，切片，展片，贴片，烤片。A.13.2切片水化、染色、水洗、脱水、复染及封片二甲苯10min2次，然后依次通过无水乙醇、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各2min，再8
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