【国家标准】 食品安全国家标准 食品中生物素的测定

中华人民共和国国家标准
GB5009.259—2023
食品安全国家标准
食品中生物素的测定
2023-09-06发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2024-03-06实施
食品中生物素的测定》。
本标准代替GB5009.259—2016《食品安全国家标准本标准与GB5009.2592016相比，主要变化如下：一增加了第一法液相色谱-串联质谱法，微生物法调整为第二法：一一第二法微生物法增加了微孔板培养法；一修改了标准的适用范围、样品类别和前处理方法；一修改了标准曲线和样品提取液制备的表述方式：一修改了检出限、定量限和线性范围。GB5009.2592023
1范围
食品安全国家标准
食品中生物素的测定
本标准规定了食品中生物素的测定方法。GB5009.2592023
第一法液相色谱-串联质谱法适用于调制乳粉、特殊膳食用食品中生物素的测定、第二法微生物法适用手食品中生物素的测定。去液相色谱-串联质谱法
第一法
2原理
试样经溶解提取，对含淀粉试样经淀粉酶酶解后，经蛋白沉淀、离心过滤后，C8反相色谱柱分离，采用液相色谱-串联质谱多离子反应监测方式检测，同位素稀释内标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂和材料
3.1.1甲酸(HCOOHD：色谱纯。
3.1.2乙腊(CH3CN)：色谱纯。
3.1.3乙醇(CH3CH2OH)：色谱纯。3.1.4甲酸铵HCOONH4）：色谱纯。3.1.5高氯酸(HCIO）70%~72%。
3.1.6氢氧化钠(NaOH)：纯度≥99.9%。3.1.7淀粉酶：Taka-淀粉酶，CAS:9001-19-8，酶活力≥100U/mg3.2试剂配制
3.2.10.1%甲酸-10mmol/L甲酸铵水溶液：称取0.63g甲酸铵，用100mL水溶解后，转移至1000mL试剂瓶中，加入1ml甲酸，以水稀释至1000mL，摇匀备用。3.2.2氢氧化钠溶液（2mo1/L）：称取8.00g氢氧化钠于烧杯中，加入100mL水溶解，摇匀备用。3乙醇溶液（50%）：准确量取500mL乙醇于1000mL试剂瓶中，以水稀释至1000mL，摇匀3.2.3
备用。
3.3标准品
3.3.1生物素标准品(CH6N2O3S):CAS:58-85-5,准物质证书
纯度≥98%，或经国家认证并授予标GB5009.2592023
的标准物质。
3.3.2生物素-D4(C,。D4H,2N2O3S):CAS:1217850-77-53.4标准溶液配制
纯度≥98%。
3.4.1生物素标准储备液（100μg/mL）：根据纯度换算精确称取10.00mg生物素标准品（精确至0.01mg),用乙醇溶液（50%）溶解、定容至100mL。溶液转移至棕色玻璃瓶中，-20℃下密封保存，有效期3个月。
3.4.2生物素标准中间液（10μg/mL)：准确吸取5.00mL生物素标准储备液（100μg/mL）至50mL容量瓶，用乙醇溶液（50%）定容至50mL。溶液转移至棕色玻璃瓶中，-20℃下密封保存，有效期3个月。
3.4.3生物素标准中间液（1μg/mL)：准确吸取1.00mL生物素标准中间液（10μg/mL）至10mL容量瓶，用乙醇溶液（50%）定容至10mL。溶液转移至棕色玻璃瓶中，-20℃下密封保存，有效期3个月。3.4.4生物素标准工作液（100ng/mL）：准确吸取1.00mL标准中间液（1μg/mL)，用流动相A定容至10mL。溶液转移至棕色玻璃瓶，4℃下密封保存，有效期1个月。3.4.5生物素标准工作液（10ng/mL）：准确吸取1.00mL生物素标准工作液（100ng/mL)，用流动相A定容至10mL。临用现配。
3.5同位素内标溶液配制
3.5.1生物素-Da同位素内标储备液（100μg/mL)：准确称取10.00mg（精确至0.01mg）生物素内标，以乙醇溶液（50%）溶解、定容至100mL。溶液转移至棕色玻璃瓶中，-20℃下密封保存，有效期3个月。
3.5.2生物素-D。同位素内标工作液（1μg/mL)：准确吸取1.00mL标准储备液（100μg/mL)，用流动相A定容于100mL。临用现配。3.6标准系列工作液配制
分别准确吸取适量生物素标准工作液手10OmL容量瓶中，准确加入生物素-D4同位素内标工作液（1μg/mL)150μL，用流动相A定容至刻度，使标准系列生物素的质量浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL和25ng/mL，每个系列溶液中同位素的质量浓度为15ng/mL。临用现配。4仪器和设备
4.1液相色谱-串联质谱仪。
4.2天平：感量分别为0.001g和0.01mg4.3恒温水浴锅：25℃~100℃。
pH计：精度0.01。
4.5超声波振荡器。
涡旋混合器：600r/min~3200
r/min。
高速离心机：≥10000r/min。
孔径试验筛（选用）。
4.9恒温培养箱：25℃~100℃。
5分析步骤
5.1样品制备
5.1.1固体样品
GB5009.2592023
采样量需大于0.5kg。非均匀样品用高速粉碎机将其粉碎至全部通过2mm孔径试验筛，混合均匀后缩分至100g，储存于广口瓶中，密封保存，供检测用。均匀性样品直接混匀，供检测用。5.1.2半固体样品
采样量需大于0.5kg。需至少采集3个包装（同一批次），将所有样品在一个容器中匀浆混匀后，其中任意的100g储存于广口瓶中，密封保存，供检测用。5.1.3液体样品
采样量需大于0.5L。需至少采集3个包装（同一批次），将所有样品在一个容器中混匀后，其中任意的100mL储存于广口瓶中，密封保存，供检测用。5.2样品前处理
5.2.1不含淀粉试样
准确称取样品2g~5g（精确至0.001g)，置于50mL离心管中，加入750μL同位素内标工作液后，加入30mL温水（35℃~40℃），振荡混匀，超声提取15min。取出后迅速冷却至室温，用高氯酸调节pH约为1.6。在4℃下，以8500r/min离心10min，经玻璃纤维过滤后用氢氧化钠溶液调节pH为4.6土0.1.样液转移至50mL容量瓶，用水定容至刻度，混匀后移取1.5mL提取液至2mL离心管中，在10000r/min下离心10min，样品溶液经0.22uμm水系滤膜过滤，上机分析。5.2.2含淀粉试样
准确称取样品2g~5g（精确至0.001g)，置于50mL离心管中，加入1%样品量的淀粉酶，750μL同位素内标工作液后，加入30mL温水（35℃40℃C），振荡混匀，放置50℃60℃培养箱内约30min，取出后超声提取15min。取出后迅速冷却至室温，用高氯酸调节pH约为l.6。在4℃下，以8500r/min离心10min，经玻璃纤维过滤后用氢氧化钠溶液调节pH为4.6土0.1，样液转移至50mL容量瓶，用水定容至刻度，混匀后移取1.5mL提取液至2mL离心管中，在10000r/min下离心10min样品溶液经0.22μm水系滤膜过滤，上机分析5.3仪器测定参考条件
5.3.1色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C，8柱（柱长100mm，柱内径2.1mm,填料粒径1.7um)），或相当者：b）流动相A为0.1%甲酸-10mmol/L甲酸铵水溶液：流动相B为乙睛：c)流速：0.3mL/min;
d）柱温：35℃；
进样体积：10μL；
梯度洗脱条件见表1。
GB5009.2592023
质谱参考条件如下：
电离模式：ESI+;
梯度洗脱条件
流动相A
监测方式：多离子反应监测(MRM),毛细管电压：3.1kV;
离子源温度：150℃；
辅助气温度：350℃：
辅助气流量：600L/h～~900L/h。参数见表2：
表2生物素各组分质谱参考参数
生物素
生物素
生物素-D4
注：*为定量离子。
5.4定性
母离子
锥孔电压
子离子
227.1*/123.1/96.9
231.1*/96.9
流动相B
碰撞能量
18/25/27
试样中生物素的色谱峰的保留时间与相应标准溶液色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在士2.5%之内。
所选择的离子均出现，而且同一检测批次，样品中生物素的两个子离子的相对丰度与浓度相当的标准溶液的相对丰度相比，其允许偏差不超过表3规定的范围。生物素标准溶液质谱扫描图及MRM色谱图参见附录A。
表3定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度(K）
允许相对偏差
K≥50%
20%≤K<50%
10%≤K<20%
5.5标准曲线的制作
5009.259—2023
将生物素标准系列工作液浓度由低到高依次注入液相色谱-串联质谱仪中，以生物素浓度与生物素内标浓度的比值为横坐标，以生物素与生物素内标峰面积比为纵坐标，绘制生物素的标准曲线。分析结果的表述
试样中生物素的含量按式(1)计算。X-exv
式中：
一一试样中生物素的含量，单位为微克每百克（ug/100g)；..1)
根据标准曲线计算得到的试样中生物素的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)：试样溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL);试样的质量，单位为克(g);
试样中量以每100克计算的换算系数；1000——
试样中ng转换成ug的换算系数。结果保留3位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其他
当称样量为5.0g时，定容体积为50mL，方法的检出限为0.300μg/100g，定量限为1.00μg/100g法微生物法
第二法
9原理
生物素是植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)生长所必需的营养素，在生物素测定培养基中，植物乳植杆菌的生长与生物素的含量呈相关性，根据生物素含量与吸光度的标准曲线计算出试样中生物素含量。
试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水或一级水。
10.1菌株
植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus8014,或等效菌株。
plantarum）［原植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)JATCC
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10.2培养基
10.2.1乳酸杆菌琼脂培养基：见附录B中B.1。10.2.2乳酸杆菌肉汤培养基：见附录B中B.2。10.2.3生物素测定用培养基：见附录B中B.3。注：可使用商品化的合成培养基，按照说明书操作。10.3试剂
无水乙醇(C2HsOH)。
硫酸(H2SO）:95%~98%
氢氧化钠(NaOH)。bzxz.net
氯化钠(NaCI)。
10.4试剂配制
乙醇溶液（50%）：量取500mL无水乙醇，加入水中，定容至1000mL。硫酸溶液A(3.0
mol/L)：量取163.2mL硫酸，加入水中，定容至1000mL。硫酸溶液B(1.0
mol/L)）：量取54.4mL硫酸，加入水中，定容至1000mL。10.4.4
硫酸溶液C(0.5
mol/L)：量取27.2mL硫酸，加入水中，定容至1000mL。10.4.5
氢氧化钠溶液A（10mo1/L）：称取400g氢氧化钠，加入水中，溶解定容至1000mL。氢氧化钠溶液B(0.1
mol/L)：吸取10mL氢氧化钠溶液A(10mol/L),加水定容至1000mL。10.4.7无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，分装于具塞试管，每管10mL，121℃下高压灭菌15min，
注：配制硫酸溶液时，要在通风橱中配制，戴手套注意安全，将浓硫酸缓慢注入水中，并不断搅拌。10.5标准品
生物素标准品(C。HN2O3S):CAS
号为58-85-5，纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书
的标准物质。
10.6标准溶液配制
10.6.1生物素标准储备液（100μg/mL)：将生物素标准品置于含五氧化二磷的干燥器中，干燥过夜。按纯度称取，使生物素含量为50mg（精确至0.1mg），用乙醇溶液（50%）溶解定容至500mL。10.6.2生物素标准中间液（1g/mL)）：吸取1.00mL生物素标准储备液（100g/mL）至100mL容量瓶，用乙醇溶液（50%）定容。
10.6.3生物素标准使用液（10ng/mL)：吸取1.00mL标准中间液（1μg/mL）至100mL容量瓶，用乙醇溶液（50%）定容。
10.6.4生物素标准曲线工作液：分两个浓度，高浓度溶液的浓度为0.2ng/mL；低浓度溶液的浓度为0.1ng/mL。从使用液中（10ng/mL）吸取2次各5.00mL，用水分别定容到250mL和500mL。注：所有标准溶液要用棕色试剂瓶冷藏于冰箱内（2℃~8℃），标准储备液保存期12个月，中间液保存期6个月，标准使用液临用现配。
11仪器和设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。6
分析天平：感量分别为0.001g和0.1mg。11.1
离心机：3000r/min~5000
涡旋混合器。
4pH计：精度为0.01。
5恒温培养箱：36℃±1℃。
r/min。
分光光度计：540nm~660nm。
酶标仪：540nm~660nm。
冰箱：2℃~8℃。
无菌微孔板。
定量滤纸：直径90mm。
试管：18mm×180mm。
容量瓶：容量100mL、250mL和500mL。单刻度移液管：1mL、5mL和10mL。11.14刻度吸管：5mL（具0.1mL刻度）。5玻璃漏斗：直径100mm。
锥形瓶：容量250mL。
烧杯：容量100mL。
分液器：0mL~10mL。
微量移液器：1000μL和200μL。11.20无菌离心管：1.5mL。
11.21针头过滤器：孔径0.22
注：清洗后的玻璃器皿和金属器具应在200℃~250℃下干热1h2h。12分析步骤
12.1测试菌悬液制备
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12.1.1用接种针将植物乳植杆菌菌株穿刺转接至乳酸杆菌琼脂培养基中，36℃土1℃培养20h~24h，取出后放入冰箱中冷藏保存，可保存1个月。每月至少传种1次，作为储备菌株保存。12.1.2将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中，36℃土1℃培养20h~24h以活化菌株，用于接种液的制备。保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，试验前应连续传种2代3代以保证菌株活力。
12.1.3将24h内活化后的菌株转种至已灭菌的乳酸杆菌肉汤中，36℃土1℃培养16h~20h。取出后将菌悬液离心弃去上清液，加入10mL生理盐水，用涡旋混合器振荡该悬液，以3000r/min5000r/min离心5min，弃去上清液。重复前述操作清洗2次3次后，再加10mL生理盐水，充分混合均匀。吸取适量该菌悬液于10mL生理盐水中，混匀制成测试菌悬液，12.1.4以生理盐水做空白，用分光光度计于550nm波长下测定测试菌悬液透光率T(%)，调整上述菌液加入量，使测试菌悬液透光率在60%～80%。12.2试样提取
注：块状、颗粒状试样需粉碎：乳粉、米粉等粉状试样需混匀：果蔬、肉、蛋、鱼、动物内脏等需制成食糜：半固体食品等试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。12.2.1固态试样：准确称取试样（精确至0.001g），置于250mL锥形瓶中，其中新鲜果蔬试样2g5g；谷类、豆类、坚果类、内脏、生肉、干制试样0.2g~1g，特殊膳食用食品1g~3g；乳粉、米粉等试样7
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g~3g；般营养素补充剂或其他食品0.2g1g。2
12.2.2液体饮料或流质、半流质试样：称取试样5g10g（或用单刻度移液管吸取适量体积)，置于250mL锥形瓶中。特殊运动饮料称取样品后不需处理，称样后直接定容至100mL(V)，按12.2.4进行稀释。12.2.3根据试样基质加入50mL硫酸溶液：特殊膳食用食品、调制乳粉等强化食品加入硫酸溶液C(0.5mol/L);植物源食品加入硫酸溶液B(1.0mol/L);动物源食品加入硫酸溶液A(3.0mol/L)。将上述混合物放入压力蒸汽灭菌器，121℃下水解30min，取出迅速后水浴冷却至室温。用氢氧化钠溶液A和氢氧化钠溶液B调节pH为4.5土0.2，移入250mL容量瓶中，用水定容至刻度（V）。用定量滤纸过滤，最初约10mL滤液应弃去，吸取5mL(V）滤液于100mL烧杯中，用氢氧化钠溶液B调节pH为6.8土0.2,移入100mL容量瓶中，用水定容至刻度(V)。12.2.4稀释：根据试样中生物素含量用水对提取液进行适当稀释(，使稀释后试样提取液中生物素质量浓度为0.1ng/mL~0.2ng/mL。12.3试样测定
12.3.1试管培养法
12.3.1.1标准曲线系列管
按表4顺序加入水、标准曲线工作液和生物素测定用培养基于培养管中，表4中每一编号需制作3管。未接种空白试管（UN）、接种空白试管（IN）、标准系列管S1～S8中生物素质量浓度分别为0ng/mL、0ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL、0.6ng/mL、0.8ng/mL和1.0ng/mL。
表4标准曲线系列管
试管号
水/mL
0.1ng/mL标准曲
线工作液/mL
0.2ng/mL标准曲
线工作液/mL
培养基/ml
12.3.1.2试样系列管
按表5顺序加入水、试样提取液和生物素测定用培养基于培养管中，表中每一编号需制作3管。每份样品需制作样品空白试管1只，管内分别加入5mL试样提取液和5mL培养基。表5试样系列管
试管号
水/mL
试样提取液/mL
培养基/mL
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