【YY医药标准】 口腔医疗器械生物学评价 第2单元:试验方法细胞毒性试验:琼脂扩散法及滤膜扩散法

ICS 11. 05. 10
国标佳
YY/T C127.9 --2009
代誉Y/T0:27.9-2001
广腔医疗器概生物学评价
第2单元：试验方法
细胞毒性试验
琼脂扩散法及滤膜扩散法
Bioiogical cvalation of medical devices used in dentistryPare 2: Test metkod
Cytotoxicity lests: Agar dilfuszom test and filter difrusion test2009-12-30发布
国家食品药品胜督管理局
2011-06-01实施
本标准是可腔医疗器诚4物学评价系列标雅中的顷标滩。YY/T 0127.92009
回腔医疗器生物学评价系列标柜中的够一单元YY/6268：2008《补学避医疗器破主物学评价第1单元序价与试验》是叫率医打器惑生物学译价与试验听日的选弹，为指南生标准该系刻标继的算二单儿是门腔医疗媒城具体车物诚验方法，共分为如下儿密公：1.YY/！0127.1—门腔格料生物试验方法辫止试验2.YY/T0127.22009二降次疗器械生领学评价第2单元：认验方法急性金身毒性诚验静练途径
3. YY/T 0127. 3-1398
点睦法科生物学泽价第2草儿：口防料生物试验寿法报管内应用试验
4. YY/T 0127. 2-2009
可腔医疗端微生物学评价第2毕元：试验方法骨埋精试验5. YY/T 0127. 5-1039
避材料生物学评价，莞享儿口腔材制牛物忘验方法吸人翡性试验
6. YY/T 0:27.6: -938
7.YY/T0127.7—2001
应用试验
8. YY/T 0127. 8
口腔挖料作物学评价，第2总元；腔材料牛物离验方法显生敏外
口腔材料生物学评价第2单光：河腔材料气物离验方法才髓牙本质口腔材料生物学评价第2单元：二降核料生物试验方法皮下植人9.YY/T0127.9-2005坚决疗器裁生物学评价第2单元：试验方法纠购事性试验：惊脂折散法及滤脱扩散法
10.YY/10127.10一2009口腔医疗诚生物学评价第2单元，试验方法鼠伤惠沙门医行商同复突变试验（Ames 试验）
11.YY/T027.11一2001好科学用下口腔的医疗器使升物相容生临床前保价第2单元·厂腔材料生物减验方法嘉髓成验
12.YY/T0127.12-2008不科学厂腔医疗器械生物学评价第2单元试验方法微核试验13.YY/T0127.13-2009腔医疗器械生物学评价穿2单：试验方法脑黏膜划激试验14.YY/T0244一1936门腔材料生物试验方法短期全身毒性试验：经口途径15,YY/T 0127.14- 2009
口腔医疗器佩生物学评价第2单元：试验方法急性经个身避性试验
16.YY/T0127.一2009口晚送疗部械生物学评价第2单：试验方沃亚急性和亚慢性全身避性就验，经口途择
本标汇为YY/T0127系列标准的第9举分。本标准是对YV/T0217.9一2001《口整材料生物单价第2单元口资材料生物试验左法细胸毒性试验：琼追模盖法及分了浓过法》的修！本版标润的技术内容精本等同采用IS07405：2008牙料学牙医疗器概生物学评价中的第6.2条琼脂扩散试验和第6.3条源膜扩激谢验。Y/T0127.9—2009
本称准根据1S07405：2008重新超常。个别方证行厂生量编轧性修取，使之更具可操作性。修改之处标准正文的右测以竖线标。并增加『资料性薪录A和附求B，以便丁与IS心?40520C8比较，
本标准与YY/T0217.92CGi相比，+摄变化婚下：一标准各称改为：“了控医疗器越生物学评价筑2单元：试验方法细胞非性试验：琼脂扩放法及滤膜扩散法”。
标准编格式逃行了改变。
二“琼脂扩散法中绢跑反应的摘述做广收变，褪色指数和溶裤指数分洲分级评价一，在涨膜扩微试验户收消了-种珀酸脱氢酶染色液配制方法。本标准从实追之日起，同过废除并代替YY/T0217.9一2001几峰材料生物学评价第2单元：L哗材料生物试验方法胞背性试验：琼胎爱盖法及分子过法》水标准由国家食品药品监肾管理局提出。本标准全国口材料和器假设备标准化技术委员会（SAC/TC99）时口，不标准出国家食品药品监督管理局北大医疗器械质量监督检验中心负责起草，木标准主要起革人：林红、郝鹏、李盛林，张研。本标耀于2001年首次发布。于2C08年第一次修订。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：.YY/T0127.1--2C01
YV/T 0127.9 2009
二搁医疗械生物学评价第2等汇试验方游胞雾性试验：琼脂扩散法及滤膜护微法本标准规定了口腔医疗器微的细地带性试验方法：琼脂散法及滤模扩散然。本标准川于检测控医疗器械在通划琼脂或脂糖扩敬后或通过醋酸纤维素滤膜扩敏后的卡特界性胞毒性。
2规范性引晨文件
下列文件中的条款通过本标准的引旧商成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随户所有的修改单（不包括期谈的内容）或修订版均不适用丁本标准+然而，鼓厕服据本标滩达感动激的各方丽究是否可使月这些文件的最新腋本：凡是不注日期的引用文件，其最版本造用于本标雅，GB/T16886.5医学器旅生物学评价筑5部分：体外纽施毒性验（3/T16886.52003，TSC10993-5:199911)
G3/16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（CB/T16886.12—2G05,TSO10992-12:2002.IDT)
YY/T026820C8习科学！腔医疗械生物学评价第1单元：详价与试验3琼脂扩散法
3.1目的
本试验用于检测国晚英疗器械在通过琼脂或琮脂糖放后的非等异性细胞声性：本试验不适用于不能逼过琼脂或琼糖扩散的可沥滤物。3.2细胞系
选用己建立细胞系的成纤维细胞系宽皮细跑系如来源自美国典型菌种保藏中心（ATCC）的细胞系，ATCCCC.1(NCTCclo:1e929）（小限成纤维细胞成ATCCCCL2（Hela)（人上皮细胞系）等应在记录中注明细跑系的编码。适用，还成在记录中注明对选用的细胞系的满述和定义，以及选用个羿性的抢证。
3.3培养基，试剂和设备
选用符合选定胞系生长要求的培养基，过滤法火菌。配制双俯浓度的细胞培养基（2×），过础法灭菌：，配制3%琼脂贼琼脂糖：高压蒸汽灭荫。临用前制备新体染色液，将1%水溶性中性红行液以1：100的比例用0.01tD:/酸盐冲滴液[如Duibeccos然缓冲液稀释。寸性红辫液应避光保存：选用有径9oiamloomm的培三逛行细胞培养。
3.4试样制
试栏制备见YY/T0268一2008第$条。根据GB/T16886.5的规定，时选用材料授提液私/或材判本身行试验。
VV/3 0127. 9- -2009
a）同依核料：倒成直径约5x的尚形试性：面光据以保语与游盖的察脂紧密接融，尚化热的材料：将阅洲的材来旗人内径证，高m的环彩费问车，在源改中狂模是的材放。当独试新解调利状态的树料时，成在填人材料之均环形模具置于综腊层！，如创试不同化时间的材料时·赢使校料充至等环形具达缘平齐，并在隔度37上，和对湿度%一10的坏境下尚化至让验开始液本材料或材料爱提液：吸取0.0=mL液体于直径为5um前灵形超组阅球玻离纤维秘纸惑其假载体上，程于琼能
性1：合造的跨性稳具材料可以呆玻或策阿翁乙器（1活3：运月的离娱可从原滤器备www.bzxz.net
3.5对照痒本
便用陷性对照，阴性对照利参照秘料（施GB/T16886.12）3.6试验步骤
培亲细胞直我达到其对微牛长期末。用牛长培基配制或2与×19细腹/m.细胞愿液，吸敢适匙终跑悬液了是够数量的培养业中，年个培券川证入m继题悬液。在37：3含5（体积分数）CO，饱和水蒸气环境下孵育2：h。如使用了不同的培养性，应进行论证。将已灭菌的琼脂或琼脂赫在水洛中加热羊100℃，然后冷8℃。将「份琼胎或琼糖与1份新配制的预热至48的2×生长培养差视介，便琼脂培齐基的最终滚度为1义牛长增举基。吸出每-培养血中的生长培养违，划10m1.新制备的保持在4℃的球脂或琼脂糖培养基，德琼胎或琼脂糖培基在温下凝固（约3℃）后，加人m中烂红活体染色液并在唯处保存15i11~0 而(有性红叶培养基应避光保存，否则将摄害细)：吸除多余的中性红游液。若适用，每个培落血中改量适量的减栏和对照材料，每个洋木问尽量保程合的离（201mm）。将培养二于37C二2℃含5%（传积分数）C0的抱和水蒸气环境下服亮21，付试验材料率少应检瓷四个平行栏（团：每一试验材料至少检查测个培葬皿），通常在每一培养同中至少放两个试样，若使用了提介质，还应放个漫提介质对点，每个样本尽量彼此远高，并远离培养血望。3.7评价指标
因有县微标尺的便管显微镜观察试验材料和对照材料的周玉褪色区诚，并按表1和表2指标计算每一试样的龈密激汇溶解数。
炭，褪色提数
褪色抱数
溶解着数
成学用制和成祥下水发现视包
买在试详下方信规色
退色区边姿距试学边缘小乎m
驱色区边缘距试学边缘在o5etn-1小tn范内驱色区线随诚送进练大于 1. m
整个培世湿色
表？ 溶解指数
未发兜非膨咨桶
小于翘色区面积20还的组啦落强褪色风面视%4%的细必落解
截色区西积43%-60%的继购济
被色区面积%80%组购济期
太工旅包区面视H0流前组脑游
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计觉带一试验材料的限急指数和滚解指数的中低，落试样的四个平行择的措数值在63范避内相老2个单位，应前复试验，似指教为或5，则不需意复试端。检测漫提滚时，应从含详的漫提介成的指数中尚减去浸提介质的指数作为试样的措数。者作为对照的漫提介质的指数中俏，则应巡用其他授据介质与复试验
注：阅性对源中卵询层究照、为有激的战验3.8结果评价
在结评价时，成考试验中收策的所有借总，完其是试验与对照组问续果的任何差异，细反应卡依据至少/个平行试验的褪色指数效溶解指数的巾值，应分别根据两个指数按表3对细胞反应进行分，
表3细胞反应(攝色指数和溶解指数分测分级)及细跑需性说明分毅
检测报告中应包含结策评价。
细犯反应
细胞诈性说听
光渐施存性
轻度维驱毒性
中度细腐摩学
贯度沿驱市性
注：在对从胞序性试给得的数好进行解释时必须考追到本试验系给的高限性，即个典有组脑带性的物料，并非不可使用，任将追材料的其体应所时应对数据进行解释3.9试验记录
试验记录中应包金部保作的记录，所得全部结果以及结果评价所需的其信任何数落，也包持试验材料制备及使用方法的详绷情况以及村料的批号（用时）。4璐膜扩散试验
4. 1目的
本标准用下检测口腔医疗器械在通过韶酸纤维奈滤膜扩散后的非特异性细胞毒性。4.2细胞系
选别乃建立细购系的成纤维纠胞系成皮纤购蒸如来源自美国费型菌和保藏中心《A以的细胆系，ATCC(XLi(NCTCcloe829)小鼠藏纤维细疤）或A7CCCCL2（IIeia)(人L皮剑系）等应在记录中提明细胞系的编码。如适用，还应在记录中注明对选用的细跑系的础述和定义：以及选别合理性的诊证。
4.3培养基，试剂和设备
按3.3定的方法制备培据和琼脂攻源脂糖。制备號珀酸脱氧酶染色液或非特异性水解海染色液
4.3.1號珀酸脱氢酶染色液的制备：先制备膜瞻酸脱氢酶存贮液：
a）琥的酸盐溶液：蜕珀酸13.6g，pH7.6的0.2mnl/L磷酸盐缓冲液100mlb）氯化硝站四氮唑蓝浒液：氯化硝基四氮哗蓝10cmg，2I7.6的0.2mol/L磷酸盐缓冲液16a m;
e）盼嗪硫酸甲酯溶液：晓嗪硫酸干酯4m，新配制的蒸馏水10 mle.
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取滤到酸溶液，氯化销证鸿蓝辫液及1m劳嗪流酸甲溶版混合制签成瑞胎酸脱氮醇樂色液。
4.3.2.非将舜性水解融染色液的制备：用非特与性水辨醇染色附，调衔费光素7酸皆存建漫，酬在1m!闪酮液中加人叫荧光素一乙酸酯。便用时取20.行贮液加人到100m磷酸垫缓冲液（如Dulhecc磷酸流级冲液便用你称内径6cmn的培辨逊行细胞培养：使用直经47m1：孔径0.45门2的废纤维索和硝纤维累混合滤膜。4.4试祥制登
试摔制备见YY/TC268：2008筑6条。限据CB/T16886.5的规定，H避用材刹漫提波确/或材料本身避行试验。
a）国体材料：制我径约5mn的圆形试洋，面光滑以探证与滤膜紧密接触。该洋的查量不超过3.
b）化类的材料：将刚调的材料填人内径5mm，高2江m的坏形模图中：当测试新鲜调可状态的艺料时，成在镇人材料之前将环形模具置手滤膜1，如测小同面化时间的料时，应使材料充境与环形模近缘平齐：并在涩度（37三2）℃，相对湿度（9010）的环镜下同化壹会试验开始。试样的重意不超过3.5g，）液体材料战材晟凝额：吸度0.0m滚体于由径为5m的圆形流细珊硅波璃纤维滤纸或其他体上置于滤膜
注1：含适防清些模材料可以是被消或桑四烯(FTFE)，注2：适用闪滤纸司从慎滤举副备。4.5对照样忘
使压阳性对照，阴链对照和参照树料（见GB/T16886.12)，4. 6 试验步骤
培养继雅肖至达到其对数生长期末，用生长培养基配制成25×1C缅跑/m1.细胞悬液产定够数量的培养血底部放灭菌的醋酸纤维素源腹。吸最组跑基毅，丁每一培养m中放直6m1.另或一皿，不含细胞的增养液6m作为空台对照，在57℃工2（含5%（体积分数）0，饱和水蒸气培养中培养24h。如使用了不同的培养祭件，应进行论证。吸取保准：48C的新制务的琼脂或琼胎糖培养（3.6)5mL了足够激量的新的空培养而中，在室流下使其凝叫。
从经过21培养含酷验纤维素源膜的血中吸除密余的生长增养液。用37℃士2℃的磷酸盐缓训液（如Julbeccos懈酸盐缓冲液）清洗滤膜，液山滤膜：放于琼脂或凉脂培养基裘而缅跑面朝下，在每一平m的滤膜上放3~~5个试样，在含5%（体积分数）0.饱和水蒸气培养箱中=57℃12℃继续孵育培养2h和24h1，应保证试样与滤膜衰面紧密接魅，在培养2l和24h后评价细胞步性，考道用，每个平Ⅲ中放叫性与性对照个，刃外增没个含单层细孢但无试验树的滤膜和一个不含细咆但接触试验材料的想膜们为空问对照，快用没凝液时，还应设漫提介质剂，每一试样爷少有四个平行样（每一试验材料牟少论查两个培养Ⅲ）。孵育后。卡除试样，轻轻将滤膜与脂或坏糖分开，取出滤膜可选用下面力法A或方法B用细胞化学方法评价纠胞嗨活性减少的面积。E）方法A
X3 0127.9-2009
按Rka和Anduscn(1963年）的方法易示號雄载多酶性（酶分类1.3.90.1）。用琥珀酸脱氢醒深色凝漫泡滤膜，在37℃十2七磨养箱本解育31.测登前历蒸增水冲洗滤膜，空气干燥注：叫将悲膜准冲洗间用关中性自降落波没泡以固定组斯。A法
月羊特异性水解醇染色液设泡激膜，在4C下孵皆30m，显示非特升性水解。在紫外光下检吉滤膜
4.7细胞摄害评价
可选用下殖a端然价细的损害：
）测量越色区积(如谨控图像分析系统)或历）按表1分缴。
裘4细胞损害评价
滤膜染色炖蔡
整个滤快染他密贯元爽化
染包密腹减少区或来契色区的经小于试样（5mtm）求染件区消径为 5--7mr
未酒色区直宿mm
稳色兰积！
202-* (:mm*
注：阴炸刘照举木下方的德膜剂照想经珀腰悦金带验色店应是均合的深色，经非特民性水熊需染包望综色。无细胞的对照滤膜可评价试单对滤膜可能产生的影响，4.8结果评价
在结果评价时：应考虑试验中收集的所有信息，尤其是试验与对照红间结果的任何差异。按表于对被试物分缴。
卵购损声搭数
检测报告中应包含缩果评价。
被试分级
组胞毒性评价
无组胞举
轻皮制胞性
中度胞毒性
重度细胞海性
注：在对从细池游培养试验架到的数据进行解整必须考虑到本试验系统的周限些：即一个只有细跑恶性的材料，并不下使月但考意材料的真体成附床对数据逃行解释4. 9试验记录
试验记录中应包指全部操作的记示，所得全部结果以及结果评价所需的其任何效据。也包括试验材料制备及使而行法的谨细惜说以及材料的比学（适用射）Y/C127.32209
附录A
【魁性阐录
本标准章装编导与19074G5：2008章条编号对照一览表非标准产务缩号
对应的国际标雅章亲综！
. 3. 6
天标准的
附录建
【资料性附录】
穿制器与翰血摘口适配性
本标准与起心7405：2008技术性差异成其原菌抗术性差尔
增圳率例ATCC.1（Nclone32）小限成纤维胞或ATCC（HIe人上皮纠临系）等最消原文选用6引培养板直径35mr0感直径50mm1~100mm的治葬肌逃行细跑培养，”的乳培养板（所径33mn)。改90mm~loum培养血
试择测备由“.1”改为“YY/T0268-2008第6条”C)中增加或其他载体L”
在篇一段中增加“使球能培养基的最终浓度为1生长落养基\和“持在8C、”
在第四没中增州“迎常在每一培养亚至少改逐两个成栏。者使用了漫提介质，还应效-一个误提介质对照。每个样本尽量筱此远离，并选离培兼血整增加举例\ATCCCCL1(NCTClo11C929)（小鼠成纤绷细施）或ATCCCCL2（Hel)（人上皮组胞系）等”样制备由\6.1\改为“Y×/0268—2C08第6条”增加“旁取一血，加不含细！包的培养6mL作为空白对照
培换作性
Y/r 0127. 9-: 2009
与后而群品间随（>20mm）晰述季店。采川国内常用培并川尺寸
中国内标准统一并参考雨齿案川材料，增加前操作性
增期可操作性
增斯可染作性
与闲为标准统一
增加可操作伴
中人民药和国医药
行业标滩
口腔医疗器减生物学评价
第2单元：试验方法
细胞毒性试验：
琼脂扩敬法盈滤膜扩散法
YY/T 0127.9--2009
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即服0.7
字数20千字
2011年5月第
20115月第一次印刷
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