【YY医药标准】 组织工程医疗器械产品聚合物支架微结构评价指南

ICS11.040.40
中华人民共和国医药行业标准
YY/T 1577—2017
组织工程医疗器械产品
聚合物支架微结构评价指南
Tissue engineering medical device products-Standard guide for microstructure of polymeric scafforlds2017-08-18发布
国家食品药品监督管理总局
2018-09-01实施
YY/T1577—2017
规范性引用文件
术语和定义
意义和用途
物理表征
8性能评价
附录A（资料性附录）
组织支架的性能要求
附录B（资料性附录）
孔径的分类
参考文献
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草YY/T1577—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出本标准由全国外科植人物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会归口。
本标准起草单位：中国食品药品检定研究院本标准主要起草人：陈亮、邵安良、章娜、王春仁。iiiKAoNiKAca
1范围
组织工程医疗器械产品
聚合物支架微结构评价指南
YY/T1577—2017
本标准给出了用于组织工程医疗产品的聚合物支架多孔材料的评价方法，包括评价孔隙尺寸、孔径分布、孔隙率、连通性，以及通透性等性能指标时可用的试验方法指南。本标准适用于聚合物支架微结构的评价。
注：这些指标对优化特定应用时的材料结构、发展有效的生产工艺路线和提供可靠的质量控制参数是很重要的。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。YY/T0606.5一2007组织工程医疗产品第5部分：基质及支架的性能和测试3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
生物活性因子bioactiveagent
器械含有的、器械表面具有的或器械内填充的任何可诱导期望的组织或细胞反应的分子成分。注：生长因子，抗生素等都是典型的生物活性因子。诱发局部有限生物活性的器械结构成分或降解副产品不属于生物活性因子。
盲（端）孔blind（end）-pore
仅通过一个直径小于其深度的孔口与外表面或可外通的内表面相连通的孔隙。注：示意图见图2b）。
闭孔closed cell/closed pore
固体内与外表面不具有任何连通性的空隙。3.4
水凝胶hydrogel
聚合物链通过化学交联或物理交联形成的开放式含水网络。3.5
大孔macropore
大于100um的孔隙（包括空隙空间）。注：一般可肉眼观察。大孔可充许化学物质，生物分子、病毒，细菌和哺乳动物细胞自由通过。对于具有相互连通孔隙的植入物，大孔提供了植人后组织易于长人和微血管形成的空间。1
HiiKAoNiKAca
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微孔micropore
孔径大于0.1m(100nm）且小于100μm(100000nm）的孔隙（包括空隙空间）。注：这一孔径范围的孔隙一般可通过常规的光学显微镜观察。微孔可允许化学物质、生物分子和病毒自由通过，但控制或减缓细菌，哺乳动物细胞和/或组织通过。通常的微孔孔径包括从细菌到普通哺乳动物细胞可通过的20uμm或更小的孔径，以及充许组织长人的30pm以上的孔径。3.7
纳米孔隙nanopore/nanoporosity孔径大于2nm（0.002um）且小于100nm（0.1um）的孔隙（包括空隙空间）注：纳米孔隙可控制或减缓化学物质、生物分子和病毒通过，但绝大多数细菌、所有哺乳动物细胞不能通过孔隙。通常的纳米孔隙孔径在可通过病毒的20nm或更小的范围内。3.8
通透性permeability
允许液体、微粒或者气体通过某一开放孔隙的能力。3.9
聚合物polymer
由特定结构单元通过共价键多次重复链接而成的长链分子，包括天然和合成材料。注：例如胶原和聚已内酯。
孔隙pore
在固体或凝胶样材料例如：由单一或多纤维构成的网状织物（纺织支架），开孔泡沫塑料，水凝胶内，可由流体（液体或气体)填充的向外连通的通道、空隙或开放空间。注：孔隙也可称为开孔、通孔。3.11
致孔剂porogen
用于在固体内产生孔隙的物质。注：例如，在有机溶剂溶解的聚合物中加人水溶性粉末。在溶剂挥发后，通常通过水将致孔剂浸出从而留下多孔结构。致孔剂的比例需要足够高才能确保所有孔隙连通。3.12
孔隙率porosity
多孔材料的特性指标，可通过测定多孔材料孔隙体积与表观（总）体积的比率确定，通常以百分比表示。
孔隙测量法
porometry
通过非挥发的润湿性流体在压力下的位移，测定相对于流体流动方向上的开孔直径分布的方法。注：孔测量法一般采用氮吸附法。3.14
孔隙率测量法porosimetry
通过非润湿性液体（代表物汞）在压力下进人有孔材料，测定孔隙体积和孔隙大小分布的方法。注：孔隙率测量法一般采用压汞法。3.15
支架scaffold
用于组织替代，修复或再生组织的细胞或生物活性因子的迁移，结合或输送的一种支持物，运输载体或基质。
iiKANiKAca
贯通孔 through-pores
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充许流体（液体或气体）从支架的一侧流动到另一侧的固有或造成的网状通道和空隙。4概要
聚合物组织支架的微结构、表面化学特性，表面形貌在细胞黏附、迁移、生长和增殖等方面发挥着重要作用。本指南的目的是提供能表征微结构的方法和技术。所述技术涉及的范围反映了对于各种力学性能不同的材料，定量分析其从纳米到亚毫米尺寸范围的孔径和孔径分布，以及孔隙率的实际困难。4.2这些聚合物支架微结构的表征方法和技术，与其他表征方法联合使用时，例如聚合物化学分析（测定相对分子质量及其分布等指标），将有助于组织工程医疗产品支架的优化。充分的表征也有助于确保支架批次间的一致性，评价不同供应商提供的基本材料，或为产业化建立规范有效的生产工艺4.3应用本指南描述的技术不能保证支架能发挥设计的预期功能，但可能有助于识别成功或失败的原因。
4.4不必进行本指南所有的试验。技术方法的选择取决于所需获取的据以及支架的物理特性，例如
侧鼠令水支架。
压汞法用于表征软材料时将因为变形而得不到有效结果，也不能用于4.5对于本指南的使用者，各种不同的用于支架物理表征的测试技不必局限于列出的技术方法。
表1支架物理表征指
表征技术
显微镜
X-射线显微计算机断层摄影
磁共振成像
密度测定法
孔隙率测量法
孔隙测量法
核磁共振
标记扩散
5意义和用途
可获取数据
孔原形状儿径和孔径分布；孔隙率Joc
孔隙形状、孔径和孔径分布；孔隙率孔隙形状、孔径和孔径分布；孔隙率孔隙率、孔隙体积
孔隙率、孔隙总表面积、孔隙直径、孔径分布平均孔径(假设孔隙几何形状为圆柱形）、贯通孔孔径分布
孔径及其分布
通透性
的适用性简介参见表1但使用者
相应的标准章条
6.1（电子显微镜）
6.2（光学显微镜）
6.2.3（共聚焦显微镜）
6.2.4（光学相干断层扫描）
6.2.5（光学相干显微镜）
5.1通过培养的功能化组织来修复体内损伤或病变的组织，这提供了除异种移植或同种异体移植之外的另一种选择。利用患者自身的细胞培养新的组织，这种方式有利于减少因免疫系统引起的排斥反应。其典型的例子是在体外将从受体获取的细胞利用支架进行培养。支架的微结构，即孔隙的孔隙率，平均3
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孔径和孔径分布，以及其连通性等对细胞的迁移、生长和增殖很重要，可参见附录A。但支架的优化设计由于可能使用的材料种类、不同的加工方法和处理条件而变得非常复杂。上述这些因素都可能影响支架的表面结构、表面化学性质和微结构。而这些因素的重要性取决于特定类型细胞在特定时期的特性（即细胞行为可因传代次数、力学刺激和培养条件而变化）。5.2一般通过总体的支架孔隙率和孔径范围来评价组织支架，而很少测定孔径分布。报告的平均孔径及其分布通常是从支架的电子显微镜图像获取的，数值在微米范围内。支架结构通常很复杂，以孔隙形状和孔径并不能很好说明其结构，特别是在三维尺度上的结构。因此，单独通过支架的电子显微镜图像难以定量评价其批次间的微结构变化，或系统研究平均孔径和孔径分布对细胞生物学的影响。5.2.1用于表征多孔支架结构的技术及其测定的尺寸范围见图1。如果要充分表征支架宜利用各种技术。
5.2.2由于在不同的应用和行业中术语定义差异巨大（可达3个数量级），孔径的分类和术语（见表2）宜标准化。国际纯粹与应用化学联合会（InternationalUnionofPureandAppliedChemistry，IUPAC）的定义与大多数生命科学（包括植入物和组织工程）通用术语间存在差异，其支持性细节论述见表2和附录B。
由于文献中还有其他一些定义孔隙的术语，因此为了避免混淆，宜对用于描述孔隙的术语进行定义。另外，取决于孔径测定方法（见表1和图1），表2中的任何定义都可能变化，因此宜同时描述所用Q
的技术方法。
热孔隙测定法
X-射线散射（衍射）
扫描隧道显微镜
纳米孔隙
电子显微镜
X-射线显微计算机断层摄影
压汞法
孔径（um）
光学成像
全息摄影
机械跟踪法
图1充分表征多孔材料所需的各种技术100
5.2.3所列出的技术（见表1）在评价复杂孔隙结构时都有所局限。贯通孔和盲端孔的示意图分别见图2a）和图2b）。对于直径有变化的贯通孔，孔隙测量法（见7.4）仅对最窄处灵敏，因此与其他的测定技术（例如扫描电子显微镜能在孔隙的不同位置取样）相比，孔隙直径的测定值较低。孔隙测量法的物理基础在于气体通过材料，因此该方法不能测量盲端孔或闭孔。基于孔隙测量法获取数据估计的孔隙率与其他方法，例如孔隙率测定法（见7.3）的不同，后者能测量贯通孔和盲端孔；与密度测定法的也不同：密度测定法能测定贯通孔、盲端孔和闭孔。这些差异的明显程度取决于各种不同类型的孔隙和其孔径所占的比例。进一步的研究将有助于指南的提高。4
iiiKANiKAca
描述词
纳米孔隙/纳米孔隙率
微孔/微孔孔隙率
大孔/大孔孔隙率
毛细管
大毛细管
表2孔径命名比较
IUPAC定义
用于化学（例如固体催化剂）、冶金、地质(例如沸石）
未定义
<2 nm(<20 A)
2nm~50nm(20A500A)
>50 nm(>500 A)
参见Meyer等
参见Meyer等
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生命科学定义
用于组织工程，医用植人物
诊断或生物学过滤处理
0.002μm~0.1μm(2nm~100nm)
0.1μm~100μm（一般限定在0.1μm~20μm）未定义
>100μm
未定义
未定义
5.2.4聚合物支架包括从具力学强度的结构体到柔软的水凝胶。而目前构建多孔支架的方法包括但不限于：
将溶解在有机溶剂且含有水溶性颗粒致孔剂的聚合物进行浇铸，然后进行浸渍。通过融化，混合不易混合的聚合物，然后浸洗出水溶性成分。在压力下将超临界二氧化碳融人充分熔化的聚合物，在玻璃化转变温度急剧降低后，由于压力的降低将导致气泡的形成和固化。熔化的聚合物可控沉积，以产生限定的三维结构。制造三维纤维编织、纺织或非织造结构。聚合物基质的化学或离子交联。5.2.5这些方法局限性的描述参见附录A。5.2.6本标准聚焦于聚合物多孔支架表征的特定方面，YY/T0606.5一2007给出了支架全面表征的要求。
具有变化的孔隙直径的贯通孔
图2不同的孔隙结构
6成像
6.1电子显微镜
b）盲端孔
6.1.1透射和扫描电子显微镜都能获取支架完整或断裂表面的图像，或支架切面的图像。所得的图像可用图像分析软件包进行解读以产生关于支架孔隙形状、平均孔径及分布的数据。而支架连续切片取样的透射电子显微镜图像产生的三维真实图像可用于估计通透性和弯曲度。5
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6.1.2对于柔软或特别是高度含水的聚合物软支架，由于样品制备产生的假象，其电子显微镜图像定量数据的可重复性可能存在高度不确定性。在常规的扫描电子显微镜观察时高度含水的支架需要在真空下冻干。该过程中如果采用液氮，由于在样品周围形成的液氮气体隔离层将导致相对缓慢的冷冻速率，会产生显著的冰晶损害。采用样品在氮浆中速冻能降低气体隔离层厚度，加快冷冻速率而减少冰晶损害。
6.1.3可使用相对新的冷冻扫描电镜技术来减少假象。在该方法中，快速冷冻的样品折断后，在冷冻扫描电镜仪器内可保持冷冻状态，经适量消除冰晶后断面再喷涂金铂。升华消除冰晶的数量可通过暴露时间来控制。这一技术的使用使样品的冻干降到最低。但难以试验验证经该技术方法获取的试验结果无人工假象。
6.1.4聚合物支架通常由于没有足够高的电子密度而不能提供合适的对比度，这能通过使用高电子密度的物质染色来克服，如对碳碳双键有高亲和力的四氧化饿。6.1.5绝大多数聚合物支架能经标准操作程序用环氧树脂固定，然后切片进行透射电子显微镜检查但这一方法不太适合研究可能脱水的水凝胶材料。不过在树脂包埋前通过使用系列浓度酒精进行梯度脱水能在一定程度上解决这一问题。但是这一操作可能降低样品中充满水的孔隙的尺寸。这样获取的孔径定量数据在比较不同样品间的微结构时具有价值。然而由于样品变形，这些结果在表征支架预期的体内微结构时作用降低。
6.2光学显微镜方法
6.2.1假若样品的结构和周围介质之间有足够高的对比度，使得最低处理条件下或天然状态（即样品不需染色或切片）的样品表面特征也能被研究，那么可应用光学显微镜方法。该方法的不足在于光线对样品的穿透有限，特别是由于散射，光线对多孔基质的穿透更为有限。实际上，这限制了共聚焦显微镜和光学相干断层技术的应用深度一般低于0.5mm。6.2.2通过光学显微镜能获取支架表面图像。改变焦距可以获得半透明样品不同景深的图像。这些深度图像可用于样品内连通孔隙的路径追踪。6.2.3共聚焦显微镜利用支架材料的天然荧光特性或诸如荧光素蛋白等荧光染料，能实质性地提高样品的光学成像质量。由于其较窄的景深和消除焦点外光线，共聚焦显微镜能拍摄不同深度的清晰图像。通常优先用激光做点光源而不用通常的照明光源，现代绝大多数的仪器使用多个激光光源。这能提高图像对比度.激发与不同的结构成分结合的染料，发射不同波长的荧光。激光扫描共聚焦显微镜能利用反射或透射模式。针孔的尺寸和目镜的数值孔径在很大程度上决定了其厚度或轴向的分辨率。通常小针孔具有更好的分辨率，但牺牲了强度。激光扫描共聚焦显微镜已用于进行一些支架表征的研究工作。6.2.4光学相干断层扫描是一种光学反射成像技术，通过对不同深度层面散射光的干涉抑制来确定轴向分辨率，而不是激光扫描共聚焦显微镜使用的针孔。简单地说，光学相干断层扫描技术使用带宽在30nm～200nm间的低相干光和干涉仪（通常是Michelson型），可产生任一横截面的背向反射剖面图。对光学相干断层扫描技术及其应用的完整描述可见。类似的技术是A型超声扫描。在迈克逊图像中，材料是干涉仪的信号臂而不是参照反光镜，低数值孔径的透镜用来获取更大的轴向取样体积，将样品的反射光按照位置的深度进行绘图。如同激光扫描共聚焦显微镜，横向分辨率由光束的几何尺寸决定，不同的是轴向分辨率与光源的带宽呈反比，典型的轴向分辨率为10mm。光学相干断层扫描技术的优势在于其高灵敏性，达90dB，已广泛用于人体视网膜，皮肤和血管，以及活体小动物的循环系统的功能显像。在20世纪90年代未期，首次预见了光学相干断层扫描技术用于材料科学领域的潜能。第一次发表的组织工程支架的光学相干断层扫描图像是关于水凝胶材料的，该研究证实了图像获取的深度。图像的探测深度受来自于材料孔隙和微晶的散射的限制。探测深度能从约100m到若干毫米，取决于材料与其周围反射指数的差异，孔隙率和孔径分布。用反射指数与支架材料相近的液体填充孔隙能提高穿透深度。实际上，通常用水替代空气，或油替代水。但这一操作因YY/T1577—2017
润湿性不足和留有空气可能导致其他问题。由于信号来源中大量的散射光子，多孔材料的光学相十断层扫描图像会有噪声。而光学相干显微镜技术，可以克服相关的组织工程支架成像失真问题。6.2.5光学相干显微镜是光学相干断层扫描和共聚焦显微镜的组合，很适合组织工程支架等不透光材料的成像，能获得微来级的轴向和横向分辨率同时保持较高的背景抑制。通常以加人高数值孔径的目镜和针孔来达到共聚焦的增强，而针孔一般为参考臂光纤上的开孔。该技术的关键是共焦和相十技术的轴向点扩散函数。对共焦而言，Lorentzian轴向点扩散函数即使远离焦平面时也是有限收敛的，这限制了其在组织工程医疗产品等高度散射介质上的应用。对相干而言，Gaussian点扩散函数在远离焦平面时的下降比共焦显微镜的更为迅速。因此，共焦有助于在焦点附近的高分辨率，而相干有助于高度背景抑制，这两种特性为组织工程医疗产品的有效成像所需。6.3X-射线显微计算机断层扫描
6.3.1X-射线能用来产生支架材料的三维图像，从而获取孔径和形状、孔隙率和连通性等信息。该方法的原理是将支架定位于X-射线源与检测器之间。旋转标本，同时在多个不同角度记录X-射线的衰减。这些数据通过重建运算法则进行分析，产生支架二维截面图像。在标本不同高度位置获得的一系列二维截面图像能形成完整的三维图像。典型的图像分辨率在5μm～10μm，但分辨率达50nm的仪器已经商品化。该技术的成功依赖于固体材料和填充在其孔隙内的流体（空气或水）间因电子密度差异而产生的高对比度。
6.3.2该技术不受限于光学断层扫描方法所受的穿透深度的限制，可提供支架结构更完整的图像。更多的信息参见ASTME1441指南。这一非破坏性的方法已用于研究骨和其他材料，确认骨组织支架的设计，以及研究聚合物支架。
6.4磁共振成像免费标准下载网bzxz
6.4.1许多聚合物含有磁共振活性核（如H、13C），但聚合物骨架上原子核的弛豫对常规的成像来说时间太短。因此，要研究聚合物支架的三维结构，孔隙内部要填充在磁共振成像中可见的流体。理想的流体要富有磁共振活性原子核，有高可感受性，有高清晰的核磁共振线谱。而且，黏度要较低以能进人孔隙，具有合适的弛豫特性以能在梯度成像中提供强信号。幸运的是，绝大多数聚合物支架在水中浸渍即能满足。
6.4.2一般磁共振成像空间分辨率的理论限值是水分子在获取磁共振成像信号的时间内的扩散距离（～10μm）。因此用此技术对具较大孔隙（50um～100μm）的聚合物支架能进行空间分辨。在磁共振图像上，水填充的孔隙显示为亮点而支架显示为黑色网络。在合适的图像分析处理后，聚合物网络的高对比图像能用来估计孔径和孔径分布。6.4.3对于孔隙小于磁共振成像分辨率限值的支架，其孔隙率能通过饱和含水支架与纯水的信号均一后的信号强度估计。如果排除测定信号中聚合物的因素，标化后的信号强度反映广聚合物支架内水的体积分数。对于水凝胶，聚合物体积分数的更准确估计来源于定量横向弛豫图。这一方法可用于分析作为辐射剂量测试模型的水凝胶的交联密度。孔隙尺寸与细胞（10um～20μm）相当的聚合物支架，孔隙内流体扩散的磁共振图像可估计孔径和孔径分布。该方法的局限性是需要通过假设几何模型来获得相关结构信息。
6.4.4磁共振成像技术的其他局限性包括较低的空间分辨率，研究支架结构时孔隙中需要填充流体，使该技术只能检测流体填充的孔隙。实际上，磁共振成像不能检测闭孔或填塞有空气的孔隙（盲端孔），或由于表面张力难以润湿的孔隙。虽然由于填塞的空气、固体聚合物或未润湿的小尺寸孔隙起某些区域的信号缺乏，但是支架孔隙内流体的分布能作为细胞能达到的孔隙体积的潜在指标。6.4.5磁共振成像技术的优势在于能无损的研究聚合物支架的三维结构，不需要使用各种染料。对支架材料的光学透过性和制样技术没有特殊要求，后者可能导致聚合物支架形状改变。另外，这一成像技YY/T1577—2017
术能用于从空间和时间上监测细胞和细胞外基质蛋白在支架内的分布。而且，磁共振成像能用手组织支架在体内的性能，以及机体对支架材料的生物反应。6.5图像分析
不管用何种技术进行组织支架的成像，必须关注关键结构指标的定量测定。通常，通过图像分析软件内的标准设定来选择数字图像内的多孔区域。包括孔原数量、孔隙面积（和孔隙体积）和总孔隙率等基本的结构指标测量都出自于这些选定的区域。关于图像获取、贮存和解释的详细信息可参见ASTMF2603。
7物理表征
7.1概要
支架通透性能用来评价细胞迁移时在支架结构上的可达到性，或测定支架结构满足功能细胞群体的能力。已描述的所有技术对聚合物支架而言都有局限性和适用范围。7.2密度测定法
7.2.1通过密度和体积间的关系能估计支架孔隙的体积，假定支架材料的密度已知。在这一过程中，支架的体积能通过测量支架的尺寸获得，然后测定样品的质量。某些情况下，为排除水分的影响，称重前可能需要将样品十燥恒重。对于凝胶或其他已知显著含水的材料，以及吸湿的材料都宜如此处理支架孔隙的体积VP按式（1)计算，孔隙率百分比为按式（2)计算。Vp=V-ma/p
式中：
Vp一支架孔隙体积，单位为立方厘米（cm）：Vi
式中：
支架体积，单位为立方厘米（cm\）；支架质量，单位为克（g）；
支架材料的密度，单位为克每立方厘米（g/cm）。P=Vp/V X 100%
支架孔隙率，%；
Vp——支架孔隙体积，单位为立方厘米（cm2）；VT
支架体积，单位为立方厘米（cm）....(1)
7.2.2孔隙率的测定提供了对样品内总的空隙空间的估计，这有一定作用，但由于它由开放孔隙、闭孔和盲端孔组成，除非与其他更特异的孔隙表征测定方法共同使用，其在实际应用中有局限性。7.2.3不规则几何形状样品的尺寸测定可能很困难。在这种情况下可使用Archimedes定律，通过样品排除的液体体积来测定样品的体积。需要注意，浮力方法对闭孔并不灵敏，贯通孔或盲端孔可能未被充分润湿。对不易润湿的蔬水性材料（例如聚已内酯），这一方法的实验操作还是挑战。然而，这样的问题能通过使用少量的促湿剂（例如1%的乙醇），或像氨比重瓶一样用惰性气体代替液体来解决7.2.4这一测定方法的可靠性还需要从测定样品尺寸和质量，以及固体材料密度的不确定性中确定对于聚合物材料，由于交联和结晶的影响，材料密度的测定可能很复杂。7.3孔隙率测量法（液体侵入）
7.3.1通过测定填充所有连通开放表面的孔隙所需的非润湿性液体（通常是水银）的体积，能估计支架8
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