【YY医药标准】 组织工程医疗器械产品生物材料支架细胞活性试验指南

ICS11.040.40
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1562—2017
组织工程医疗器械产品
生物材料支架
细胞活性试验指南
Tissue engineering medical device productsBiomaterial scaffolds-Guide for cell viability evaluation2017-03-28发布
国家食品药品监督管理总局
2018-04-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草YY/T1562—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标准由全国外科植人物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会（SAC/TC110/SC3)归口。
本标准起草单位：中国人民解放军第四军医大学、中国食品药品检定研究院本标准主要起草人：金岩、张勇杰、徐丽明、罗海浪、邵安良、方玉、付海洋YY/T1562—2017
活性细胞和无活性细胞在生物材料支架表面或内部的数量和分布是决定细胞/生物材料支架构建物产品性能的重要特征之一，也是评价生物材料支架的细胞相容性的指标之一。因此，作为用于修复与再生缺损或疾病组织的组织工程产品的重要参数，有必要对细胞活性定量检测的方法进行标准化虽然细胞活性对于组织工程医疗产品（TEMP)来说是个非常重要的特性，但TEMP的生物活性还受其他参数的影响。推荐使用其他检测方法以评估和确定细胞类型、蛋白表达，基因图谱、分化过程及程度、活化状态、形态等特性。建议在使用生物材料支架复合细胞之前，按照相关要求完成生物材料支架的生物相容性基本检测。iiiKANiKAca
1范围
组织工程医疗器械产品生物材料支架细胞活性试验指南
本标准给出了对生物材料支架进行生物学评价时的细胞活性评价指南。本标准适用于组织工程医疗器械产品的生物材料支架2规范性引用文件
YY/T1562—2017
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。YY/T0606.13组织工程医疗产品第13部分：细胞自动计数法YY/T0606.25组织工程医疗产品第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
活性细胞
viablecell
能够进行新陈代谢活动，结构完整，具有功能细胞膜的细胞3.1.2
non-viable cell
无活性细胞
不符合3.1.1中列出的活性标准的任何一项要求的细胞3.1.3
biomaterial scaffolds
生物材料支架
具有细胞或生物活性因子迁移，结合或输送功能，用来替代，修复或再生组织的支持物，释放载体或基质，用以诊断、治疗、修复或替换机体组织、器官或增进其功能。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BrdU：溴脱氧尿苷（5-bromo-2-deoxyUridine）；calceinAM：钙荧光素乙酰氧基甲酯（calceinacetoxymethylester）；DAPI:4，6-二基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole）；G6PD：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase）；LDH：乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase）1
HiiKAoNiKAca
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MTT：3-[4.5-二甲基噻唑-2]-2,5-二苯基四氮唑溴盐3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)；
MTS:3-（4,5-二甲基吡啶-2-苯基)-5-（3-羧基甲氧基苯基)-2-（4-磺苯基)-2H-四唑内盐［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetraolium,inner salt;WST：2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺基苯基）-2H-四唑盐1-2-（4-lodophenyl)-3-（4-ni-trophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium);XTT：2,3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-2H-四唑-5-羧酰苯胺2，3-Bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide)。4概述
本标准概述了定量检测有孔或无孔、坚硬的或柔软的生物材料支架内部或表面活性细胞和无活性细胞的数量及分布的常用方法。这些方法既可以用于测定生长在完整三维生物材料支架或基质内的细胞（非破坏性方法），也可以用于已经从支架或者基质中提取的细胞（破坏性方法）。除了提供现有技术的概述，本标准也描述了生物材料支架与细胞活性试验特定的相互作用，这些相互作用能够干扰细胞活性分析的精度。另外，本标准还描述了如何避免和/或者判断生物材料支架与细胞活性试验相互作用产生的干扰。本标准中大多数方法来源于二维培养的细胞数量分析，但是经过调整已能够用于分析三维构建物内细胞的情况。本标准探讨了这些方法的机理和灵敏度。部分试验采用二维培养的细胞建立标准曲线，由此产生的局限性在本标准中也有所说明。此外，本标准中还就生物材料支架本身对活性检测试验影响进行了阐述，
当多种测试方法组合使用时，可更为精确地测量活性细胞、无活性细胞的数量和分布。目前，有多种静态或动态方法将细胞接种在生物材料支架上。每种方法有不同的细胞接种效率。总体来说，静态方法相比动态方法的接种效率要低。本标准阐述的方法能够协助建立起细胞接种方法与接种效率的关系，并且能够对特定接种方法下的活性细胞数量进行标准化检测在培养或移植过程中，较厚的生物材料支架或者富含细胞的生物材料支架会导致传质障碍（物质扩散受限），造成构建物中央的细胞死亡，只有外缘有活性细胞。这种活性细胞的空间分布差异可采用本标准中的检测方法进行定量。另外，培养方法或者生物反应器条件对于材料内部细胞活性的影响同样能够通过本标准中的方法进行评估。5评价方法的选择bZxz.net
5.1表1概述了用来定量生物材料支架表面或内部细胞活性的方法（但不限于这些方法）。需要注意的是，这些方法常需要联合应用以确定活性细胞和无活性细胞的总数量，另外，可进一步检测具有增殖活性的细胞数量。增殖的细胞具有活性，但活性细胞不一定都增殖。即使无活性细胞结构不完整或不能进行完整的新陈代谢行为，仍可以采用使染料通过破损的细胞质膜进入细胞的方法将无活性细胞鉴定出来。
-iiKAoNniKAca
检测指标/检测方法
I总细胞数目
DNA检测
结晶紫染色
ⅡI活细胞数目
代谢分析（ATP含量）
四唑盐试验：MTT,MTSWST,XTT
AlamarBlue染色
中性红染色
葡萄糖消耗试验
细胞增殖（DNA合成）分析：
H-胸腺嘧啶或者BrdU标记
染料排斥试验：台盼蓝，赤藓红，苯胺黑流式细胞术分析
细胞自动计数仪分析
亚活细胞/死细胞比率
细胞检测与评价方法
破坏性的（需要将细胞从
支架或基质上分离）
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非破坏性的（检测时细胞
仍然在支架或基质上)
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根据质膜完整性利用双重荧光染料的活/列检测
非荧光染料排除试验
流式细胞术分析
IV成像
细胞密度、形态和空门
组织切片观察
共聚焦显微镜观察
扫描电子显微镜观察
磁共振成像观察
Micro-CT观察
注“×\表示可以适用。
细胞在三维构建物内的总数量，包括活性细胞和无活性细胞数量，一般可以通过DNA检测分析（见6.1.1)来确定，测定方法见YY/T0606.25。这些分析是在细胞被破坏性地从生物材料支架上分离再被裂解后进行的，可以间接地确定细胞总数量。由于很多细胞与生物材料支架粘附较牢固，在细胞分离过程中会对细胞造成破损或丢失。因此，简单通过人工计数完整染色细胞或未染色细胞并不可靠。如果采用细胞悬液计数，可以采用YY/T0606.13的检测方法5.3
如果只确定活性细胞的数量，可以使用荧光或比色的新陈代谢指示剂，这些指示剂可根据细胞进行新陈代谢活动时对生长培养基发生的化学还原反应产生荧光或者改变颜色。新陈代谢试验在生物材料支架破坏和非破坏形式下都可以使用。3
iiiKAoNikAca
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MTT或MTS试验可以在破坏环或非破坏形式下使用，常用的方法是采用分光光度计来检测（见6.2.1）。AlamarBlue法（见6.2.3）是一种非破坏性方法，需要使用荧光计。二维和三维培养环境相比，即使在相同的细胞数量下，细胞的代谢会截然不同。因此，利用在二维培养的细胞生长曲线来校准在三维结构上的细胞数量可能是不准确的。值得重视的是代谢试验是直接检测细胞产生的胞内酶的活性。尽管酶活性的水平通常与活性细胞数量呈线性相关，但在某些情况下，代谢试验检测结果不一定与细胞数量呈线性比例，如某些特定培养条件可能会影响被检测酶的产生和活性，或者在某些环境下底物没有被限制。尽管有这些缺点，以上方法仍然广泛使用（见6.2）。
5.5总细胞中活性细胞的数量可以通过增殖或者代谢试验来确定（见6.2）。但是这些试验不能提供活性细胞在构建物上的分布信息。因此，通常使用成像技术来观察染料标记的活性细胞或无活性细胞的形态以及空间分布（见6.4)。
5.6本标准也包含了检测在生物材料支架内或者生物反应器内总细胞的细胞活性非破坏性检测方法，这些方法对于开展细胞数量和分布随时间变化的动态研究非常有用。5.7生物材料支架可能会对试验产生干扰，所以在试验中生物材料支架必须作为对照来确定其是否会对试验产生影响。如果生物材料支架的确对试验有干扰作用，那么就必须排除生物材料支架的干扰或者选择另外一种试验方法。以下每个试验的说明中列出了已知干扰的注意事项。5.8细胞密度会影响定量的准确性。细胞低密度生长一般较难消化毒而生长至整片的细胞可能较易消化。对于某些产品而言可以尽量提高细胞的接种密度，但高密度有可靠会影响染料的结合。5.9在很多情况下不同的细胞可能会混合培养。由于一些细胞的代谢活性高于其他细胞，代谢试验不能精准地确定混合培养的细胞数量。利用染料检测的方法也存类似问题：例如，细胞核的大小可能不均一（尽管有可能相近）；细胞质的体积和细胞突起的数量可能差异较大；在一个混合细胞群中，有些细胞处于快速增殖期，而有些细胞可能处于有丝分裂后期。5.10生物材料支架有透明的或不透明的、坚硬的或者易碎的等不同特性。对于易碎的生物材料支架来说，在处理过程中细胞可能会掉落。建议尽量选用操作步骤较少的方法。另外需注意的是：生物材料支架也会随时间变化发生降解生物材料支架边缘可能比内部要柔软一些；生物材料支架不一定有均一的厚度或密度，这可能会影响统计分析。6确定细胞活性的特定检测方
细胞总数测定
6.1.1DNA检测
DNA检测是确定细胞总数（包括活性细胞和无活性细胞）常用的方法。用于检测DNA含量的商业试剂盒一般都可以使用。在分析之前从生物材料支架上完全提取细胞很重要。如果需要检测细胞荧光，可以利用蛋白酶K消化去除细胞内任何残留的内源荧光。具体试验方法可参照YY/T0606.25。注1：提过程注意保护DNA的稳定性，防止DNA降解注2：荧光定量检测DNA时注意DNA纯化回收率对结果的影响：若供试品对回收率和精密度无干扰，可直接测定，若精密度好，但供试品轻微干扰回收率时，无需对供试品DNA做进一步纯化，可直接测定，但每次测定均应增加回收率实验，并用回收率对测定结果进行校正，若供试品严重于扰回收率和精密度，应采用适宜方法纯化DNA以排除干扰，直至精密度和回收率试验均符合要求。需要纯化DNA后再进行测定的供试品，每次测定均应从纯化步骤起增加回收率实验，并用回收率对测定结果进行校正。6.1.2结晶紫染色
结晶紫是一种用来确定总细胞数量的染料，其能够与活性细胞和无活性细胞的DNA结合。在分4
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析之前必须先将细胞从生物材料支架上分离。用磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗细胞之后，用合适浓度的结晶紫甲醇溶液在一定温度下染色10min~30min，然后充分洗涤，在570nm～590nm波长下用酶标仪测量吸光度。
6.1.3流式细胞术分析
流式细胞仪可以同时检测单个细胞的多种细胞参数。对细胞的某一待测成分进行特异性荧光标记后进行检测，包括DNA成分及含量、RNA含量、细胞表面和细胞内的各种抗原，细胞功能活性检测等，分析范围很广且特异性强。流式细胞术测定细胞时，以细胞流速评价细胞数量。流速越快，其单位体积所含细胞数量越多，且流速与细胞数量成正比。联合使用区分活细胞与死细胞的染料，例如用碘化丙锭(PI)染色其中死亡的细胞，可以用于细胞存活率测定。而且，结合不同的荧光抗体还可测定混合细胞中细胞亚群存活率。用于流式细胞分析的样本需是单细胞悬液。流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在2℃～6℃下进行操作。否则，荧光抗体进人死细胞内，会产生非特异结果。6.1.4细胞自动计数
细胞自动计数仪避免了人工计数的繁琐和主观性，检测时应用台盼蓝染色法和图像分析法，快速完成细胞计数和存活率计数。在检测之前必须先将细胞从生物材料支架上分离并制备成单细胞悬液，具体方法可参考YY/T0606.13。
6.2用于确定活性细胞数量的增殖或代谢试验6.2.1四唑盐试验（MTT，MTS.XTT或WST法）6.2.1.1概述
细胞代谢的活性通常采用四唑盐转化的比色法试验进行检测，常用的四唑盐如MTT。细胞吸收了四唑盐后通过线粒体中的琥珀酸-四唑还原酶系统将四唑盐转化为甲晶体。甲喷染料的量与代谢旺盛的细胞数量直接相关，试验结果采用酶标仪读取。6.2.1.2试验方法
试验方法如下：
a）在试验开始前，接种细胞的生物材料支架应该用无血清的培养基或者PBS冲洗以去除未粘附的细胞。由于生物材料支架与试验试剂可能会有化学作用，或者生物材料支架本身就有吸光度，所以应采用未接种细胞的生物材料支架作为对照。采用已知数量的细胞标准样品建立标准曲线。b)
相似样本的吸光值之间如果存在较大但未超出范围的差异，可以归因于细胞状态产生的差异。注：实验中宜避免其他试剂引起的直接的MTT还原反应，另外，宜注意因MTT本身掺人组织形成的本底值。在MTT法中需使用异丙醇或二甲基亚砜溶解难溶的甲晶体，这可能对生物材料支架和细d)
胞造成损伤。水溶性MTS试验不需要溶解甲晶体，该试剂盒包含一种四唑盐化合物3-（4，5-二甲基吡啶-2-苯基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑内盐、MTS（a)和一种电子耦合试剂（嗪硫酸乙酯，PES）。XTT试验也因为生成水溶性的甲而比MTT更容易操作，在XTT试剂盒采用XTT（2.3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基）-2H-四唑-5-羧酰苯胺）代替MTT。WST法是一种基于2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基)-5-（2，4-二磺基苯基)-2H-四唑盐（WST-1)的非破坏性检测方法。氧化还原指示剂刃天青同样适用于非破坏性检测细胞增殖。
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6.2.2ATP含量测定
ATP的含量和氧的摄取被证明可以评估细胞活性，如与胰岛细胞活性高度相关。另外，也可采用非破环性的P核磁共振检测高能量磷代谢，尤其是活组织中的ATP和磷酸肌酸，也可采用稳定同位素标记的O和质谱获得更为详尽全面的动态代谢信息。6.2.3AlamarBlue法
AlamarBlue法使用无细胞毒性的氧化还原代谢指示剂，这些指示剂根据细胞生长时对生长培养基中化学还原剂发生的反应产生荧光或者改变颜色。鉴于试验是无细胞毒性的，所以可以非破坏性地重复试验来评估细胞活性和细胞增殖情况。该方法对非增殖细胞同样适用。这一方法的优势就是在分析之前，不用从生物材料支架上分离细胞。根据单位时间已知数量的细胞与试剂反应的数值建立标准曲线，利用荧光计或者标准的分光光度计来读数。6.2.4中性红试验
中性红试验基于活细胞能快速将染料吸收人溶酶体的原理。在细胞与染料孵育之后，将细胞裂解通过分光光度法来确定染料的吸收情况。当细胞活性显著增高，溶酶体摄取染料作用激活。对待测细胞与对照样本的摄取染料含量进行对比，报告以相对于对照组细胞的活性百分比形式给出。注：中性红染料在光照下有毒，所以在处理试剂时宜有安全预防措施。6.2.53H-TdR或者BrdU标记
在细胞周期的合成期氛化胸腺嘧啶能够掺人细胞的DNA中，这一方法被广泛使用，能够灵敏地检测DNA合成的速度以及细胞增殖情况。接种细胞后将细胞与氛化胸腺嘧啶进行孵育，在每个细胞分裂时，氛化胸腺嘧啶会掺人新合成的染色体中。细胞分裂次数越多（或者细胞增殖速度越快），掺人细胞DNA的放射性越强。在孵育之后，将细胞收集，破环细胞之后使DNA释放出来，细胞碎片和完整的DNA通过过滤器收集。细胞在孵育期间增殖速度越快，收集的含有放射性DNA的细胞越多。在滤膜十燥之后，在闪炼计数器中测定放射剂量（与孵育时的细胞分裂次数对应）。注：已有证据表明\H-TdR这一放射性化学物质能够诱导细胞周期停滞和细胞凋亡，在测定增殖速度的时候会产生错误的数据。本试验检测过的细胞无法继续用于其他检测。BrdU是胸腺嘧啶的类似物，通常用来替代’H-胸腺嘧啶，它也能掺入复制细胞新合成的DNA中。BrdU通常用来检测活组织的增殖细胞。可以采用BrdU特异性的抗体，通过流式细胞术、免疫细胞化学或者酶联免疫类型分析等检测方法，检测BrdU化学物的掺入情况。抗体的结合可以通过将细胞酸处理或加热的方法使DNA变性实现。
注：这一步可能会对生物材料支架造成损伤。6.2.6葡萄糖消耗试验
培养细胞的葡萄糖消耗试验是另一种测量细胞生长和代谢的方法。通过检测给定类型、确定数量的细胞孵育前后葡萄糖含量建立标准曲线，分光光度计测定试验可以对葡萄糖消耗进行定量。注：需要选择合适的分析方法，以避免细胞培养基中的酚红和血清产生光谱干扰。6.2.7酶解报告底物
利用培养液上清液中的酶解报告底物的能力来测量细胞活性，包括比色法，荧光法或冷光法等。在6
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细胞膜受损之后，会从细胞中释放出来一些可以作为细胞死亡指示物的酶，例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)和乳酸脱氢酶（LDH）。这些方法的优势在于可以从动态的培养液取样检测注：进行LDH活性的比色测定时，用含血清培养基制备的组织工程产品，其检测结果可能会受到残留血清的干扰。
6.2.8利用增殖试验检测三维构建物内的细胞活性的注意事项6.2.8.1由于营养物进入支架/细胞层内部的差异，细胞接种在厚的（超过1mm）三维生物材料支架或长成细胞膜片，它们的代谢输出有一定差异。因此，即使DNA含量增加，代谢活性也不一定相应增加。自前，没有办法来计算这一差异。因此，必须采用二维培养矫正曲线。中空纤维培养系统可以作为一种三维培养对照物。
6.2.8.2支架的厚度可能会影响试验试剂扩散到支架内部，从而影响试验试剂对细胞的处理。重复样本中，不可能让所有支架样本具有完全一样的天小或者尺寸，所以需要注意一些支架体积或重量。6.2.8.3可降解的支架材料，当其降解时所释放的代谢产物可能会影响对pH变化敏感或依赖代谢活性的试验。
6.2.8.4染料还原反应主要依赖线粒体代谢，可能无法用于通过厌氧反应维持功能的组织，6.3染料排斥法区分活性细胞和无活性细胞染料排斥试验是粗略估计细胞活性的最简单方法之一。这种方法利用一个指示剂显示细胞膜的破损情况。能够吸收染料被染上色的细胞被认为是无活性的。例如，台盼蓝、赤藓红、苯胺黑都是常用染料，其中台盼蓝在原代培养中最常用。细胞需要从支架上分离下来，与染料混合几分钟后计数。因为台盼蓝是有细胞毒性的，细胞在加人浓度为0.4%的台盼蓝后必须立刻计数（几分钟到十几分钟内）。随着细胞密度增加，数据的标准偏差变大。因此，样本应该稀释到合适的密度。6.4检测细胞的成像或可视化方法6.4.1概述
为了检测细胞在生物材料支架内的空间分布，使用显微镜（例如，传统的光学显微镜，激光共聚焦显微镜或者电子显微镜)观察细胞是非常必要的，6.4.2成像观察生物材料支架内部细胞的注意事项6.4.2.1染色很可能不均一，必须通过成像观察进行确认。6.4.2.2如果使用生物材料支架，生物材料支架可能吸附染料或者有背景的自发荧光。6.4.2.3由于成像仪器和显微镜的景深较浅，定量生物材料支架内部的细胞或厚的生物材料支架切片上的细胞可能比较困难。若生物材料支架未水平放置，则可能仅有一部分细胞处在焦平面。共聚焦分析部分避免了这个问题，但也可能存在计算误差。最精确的方法是连续切片的三维重建。自前：一些软件包能够实现这个功能，但价格昂贵，速度较慢。6.4.3组织切片染色
传统的组织切片的染色、计数能够衡量细胞接种的均一性。6.4.4荧光标记活性细胞或无活性细胞活性/无活性细胞检测最常用来确定活性细胞与无活性细胞的比率。通常钙黄绿素AM可被活性YY/T1562—2017
细胞吸收发出绿色荧光，乙啡啶二聚物可以被膜受损的无活性细胞吸收发出红色荧光，其他合适的染料也可使用。一些生物材料（特别是软的生物材料）可以制备切片后用酶标仪计数定量。也可以采用商业化的荧光抗体标记有增殖活性的细胞或无活性细胞，然后采用流式细胞仪计数和分类。有的细胞通过基因修饰后会自发荧光，这种情况下应该采用二维培养和限定数量的细胞来计算特异性荧光值。6.4.5共聚焦显微镜
在用荧光标志物标记活性细胞或无活性细胞后，共聚焦显微镜能用来区分构建物内活性细胞和无活性细胞的分布。因为共聚焦显微镜通常最大只能穿透几百微米，因此有必要使用多个切片来定量构建物内活性细胞的比例和分布。双光子共聚焦显微镜成像利用细胞的自发荧光对三维支架中的细胞活力进行分析，这种方法无需对细胞进行染色或将细胞和材料分离，但细胞类型决定的细胞自发荧光的光谱和强度决定了成像的效果。共聚焦显微镜的应用在一定程度上受到样本厚度的限制，而多光子成像技术能在一定程度上避免这个问题。根据切片的厚度，无共聚焦功能的显微镜也可以被用于定量活细胞数目，提供构建物内部的三维细胞群体的信息。6.4.6扫描电子显微镜
细胞接种和长人生物材料支架的程度和均一性能通过扫描电子显微镜或者环境扫描电子显微镜（E-SEM进行分析。细胞固定需用传统电子显微镜的组织固定和脱水方法进行。E-SEM需要进行的试验准备较少[例如，观察前用钾次酸盐缓冲液配置的2.5%（体积分数)戊二醛处理1h]。冷冻扫描电子显微镜（Cryo-SEM)不需要固定样品。样品冻干后直接转移到小室分析。通常，样品中间及外表面都需要分析。
6.4.7磁共振成像
对于非常厚的生物材料支架（毫米级到厘米级），可以使用氧化铁或钇造影的高磁场磁共振成像。这种方法的应用受到分辨率和对比度的较大制约。6.4.8 Micro-CT
Mirco-CT具有较高的分辨率，可对体外及活体内的组织工程构建物进行定量或空间分布的检测，检测前一般需用四氧化钱对细胞进行标记，增加细胞的显影。6.4.9成像分析
6.4.9.1概述
除了使用成像分析软件来定量荧光标记的细胞数目，还可以完成其他一些更复杂的分析，例如，分析细胞密度，细胞伸展以及活性细胞和无活性细胞的空间均一性，6.4.9.2细胞密度分析
应在分析前对细胞进行染色。通常采用细胞核染料，如4'，6-二基-2-苯基吲哚（DAPI)，来确定细胞位置。可以沿着构建物横截面采集连续深度的多色图像。需注意避免支架材料在制片过程中破碎如果定量大多数长在生物材料支架外部的细胞，可能比定量均勾分布在表面的细胞更为困难。细胞聚团可能会影响计算的精确性，如果细胞在生物材料支架表面或内部成族或聚集，细胞数自的统计可能不准确，例如，胰岛或神经球中一群细胞可以含有成千上万个细胞紧密包裹在一起。8
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