【YY医药标准】 多孔生物陶瓷体内降解和成骨性能评价试验方法

ICS11.100
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0511-2009
多孔生物陶瓷体内降解和
成骨性能评价试验方法
Test method for evaluation of the biodegradation andosteogenesis of porous bioceramic in vivo2009-12-30发布www.bzxz.net
国家食品药品监督管理局
2011-06-01实施
YY/T0511—2009
本标准参照ISO10993-6：2007《医疗器械生物学评价第6部分：植人后局部反应试验》中有关植人方法，并在对国内外相关文献分析验证的基础上，结合多孔生物陶瓷体内降解性能和成骨性能的特点制定而成。
本标准附录A为资料性录。
本标准由国家食品药品监督管理局提出。本标准由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会归口。本标准起草单位：上海生物材料研究测试中心。本标准主要起草人：孙皎、沈晴肤、黄暂玮、卢建熙、薛肠、陆华、丁婷婷。1范围
YY/T0511—2009
多孔生物陶瓷体内降解和成骨性能评价试验方法本标准为评价多孔生物陶瓷体内降解和成骨性能提供指南。本标推规定了材料植入骨组织后，对材料的降解和成骨性能进行定性及定量评估的试验方法。本标准适用于植人到活体骨组织内多孔生物陶瓷的降解和成骨性能的评价，不考虑机械或功能负荷对其的影响。降解程度的评价系根据材料在骨组织内产生的降解反应，成骨能力的评价系根据骨组织内新骨生成的程度。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1一2001，idtISO10993-1:1997)
GB/T16886.2医疗器械生物学评价第2部分：动物保护要求（GB/T16886.2-2000，idtISO10993-2:1992)
GB/T16886.6医疗器械生物学评价第6部分：植入后局部反应试验（GB/T16886.6一1997，idtISO10993-6:1994)
GB/T16886.9医疗器械生物学评价第9部分：潜在降解产物的定性和定量框架（GB/T16886.9-2001,idtISO10993-9:1999)3术语和定义
GB/T16886.1和GB/T16886.9中的定义和下列定义适用于本标准。3.1
多孔生物陶瓷porousbioceramic含有较多孔洞，其孔洞结构具有一定生物功能（如有利于细胞/组织的长人和代谢）的一类无机非金属材料。
注：多孔生物陶瓷举例：β一磷酸三钙多孔生物陶瓷(β一TCP)、羟基磷灰石多孔生物陶瓷(HAP)等。3.2
成骨osteogenesis
骨的形成过程。
植入物初始量initialmaterialvolume（IMV）植人物植人前不包括孔内面积的横截面总面积。3.4
植入物剩余量residualmaterial volume（RMV）植人物在组织内残留的不包括孔内面积的横截面总面积。YY/T0511—2009
植入物横截面积material crosssection（MCS）植入物植人前包括孔内面积的横截面总面积。3.6
新骨生成量newboneformationvolume（NBFV)植人物横截面内所形成的新骨总面积。注：新骨指新生的骨组织。
4试验方法
4.1原理
本方法系将多孔生物陶瓷材料植人到实验动物骨组织内一定时间后，通过组织学检查的方法，结合图像分析系统的分析，对试验材料植入物与已经被临床所接受的同类材料植人物的降解性能和新骨形成能力进行比较和评价。
注：在进行体内降解试验前宜先按照GB/T16886.14的要求对植人物进行定性与定量分析。4.2植入样品的制备
4.2.1试验材料
试验样品的物理特性（如形状，孔隙率，孔径等）可影响试验材料的降解性能。每一个试验样品都应经过与最终产品相同的制造、处理、污物清除及灭菌过程，样品制备和灭菌后，应特别注意在植人前或植人过程中不使其受到擦伤、损坏或任何污染。对于组织工程支架材料，应考虑采用不含细胞的供试品做试验，因为动物对细胞成分的免疫反应和细胞对动物的反应可能会干扰局部组织反应的结果。4.2.2对照材料
对照样品的尺寸、形状应与试验样品一致。对照样品所采用的处理、清洗及灭菌方法应能使其保持可接受性和良好的对照性。
对照材料应选择与待选试验材料预期用途一致的、已经被临床所接受的同类材料。4.2.3植入样品尺寸
植入样品的尺寸应根据所选用动物、材料的孔隙率大小及其骨组织的大小来决定，原则上应参见GB/T16886.6的规定，推荐选用圆柱状植入样品，以避免机械因素造成的组织反应。对具有一定孔隙率的植人样品，在选择兔或狗作为实验动物时，植人体可加工成直径4mm～6mm、长8mm~10mm的圆柱体。
注：其他相关信息见GB/T16886.6。实验动物和植入部位
实验动物
应按照GB/T16886.2规定的实验动物要求选择动物和设计；动物饲养与管理应符合国家有关动物饲养的规定进行。
骨内植入试验所需时间较长，一般首选新西兰免，体重不小于2.5kg。注：其他相关信息见GB/T16886.6。应足以保证每一植人期至少能获得10个试验样品和10个对照样品的数量。2
4.3.2植入部位
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应参照GB/T16886.6规定选择适宜的植人部位，试验样品与对照样品应以相同条件植人到同一年龄、性别，同一品系同种动物的相同解剖部位，建议在一只动物的左右两侧分别植人试验样品和对照样品。
选择植人部位时，应确保植入手术不会造成试验部位病理性骨折，对年幼动物应避免将植人物植人到区或其他未发育成熟的骨内。一般推荐选择股骨远端踝部骨作为植人部位，与冠状面平行植入，植人时应避免材料进人骨髓腔和关节腔。4.4骨植入手术
在麻醉和无菌条件下，于双侧膝外侧作纵切口，用止血钳分离组织暴露出股骨外侧。采用比植入物直径略小的钻头，在质量浓度为9g/L的无菌氯化钠注射液冲洗下，低速间歇地在双侧股骨外侧各钻一个腔洞，深度与植人物的长度接近，清除骨屑，将样品轻轻按压植人，使样品表面平于或略低于骨皮质表面，左右各植入一枚，一侧为试验材料，另一侧为对照材料，随后分别缝合肌筋膜和皮肤切口。注：植人物直径与骨植人床匹配良好对于避免纤维组织向骨内生长至关重要。4.5试验周期
试验周期的确定应根据试验样品的预期用途和降解性能而定，体内动物实验前应事先评估试验样品的降解时间，降解时间可以通过体外实时、加速降解试验或特定环境下的数学模型来推算。原则上观察期应至少设置三个时期，试验周期一般应长于试验样品降解和被吸收的时间，或应能使相应的组织反应达到一稳定状态。通常可设置以下三个时间点：一没有或仅有少量降解；
一降解发生的过程中；
组织修复处于稳定状态或植人物几乎完全降解。术后植入物的降解率及周围组织结构的改变随时间而变化。对于预期在12周内可以完全降解的多孔生物陶瓷，推荐选择2周、4周、12周三个观察期；对于预期超过12周完全降解的多孔生物陶瓷，可酌情选择4周、12周、26周、52周或更长时间为观察期。5结果观察与评价
5.1临床观察
植入后1天、3天和5天观察植入点皮肤反应，有无出血、红肿和植人物排出等异常现象。在植人周期内每天观察动物的一般状态，并记录任何异常现象，包括局部、全身和行为异常。记录死亡的动物数并及时进行户检，垂死动物及时隔离并处死。5.2解剖观察
按照GB/T16886.2的要求处死动物，肉眼观察植人部位组织有无异常病变。5.3植入物切取和标本制备
切取包裹植人物及其周围约1.0cm~2.0cm的组织，将其置于4%的中性缓冲甲醛溶液中固定，制备不脱钙硬组织显微学检查的标本。不脱钙硬组织显微学检查的标本制备详见附录A。在制作组织切片时，每一植人点分别需要切取松质骨内外、中、内三个部位的组织。3
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5.4不脱钙硬组织显微学检查
采用不脱钙的硬组织显微学检查方法，定性和定量分析多孔生物陶瓷的降解和成骨性能。5.4.1降解和成骨性能的定性分析光学显微镜下观察植入部位植入物是否发生降解和新骨生成，并观察、描述新骨的成熟度（包括编织骨、板层骨、骨髓等）。
5.4.2降解和成骨性能的定量分析5.4.2.1采用图像分析系统[Bioquant专用计算机、ImageProPlus5.0（MediaCybernetics）图像分析软件、LeicaDM4000B显微镜」，分别定量分析植人物初始量、植人物剩余量、植人物横截面积以及新骨生成量，计算植入物降解率及新骨生成率。5.4.2.2按式(1)计算植入物降解率（MDR)：MDR(%）=（1-RMV/IMV)X100%
式中：
植人物降解率；
植人物剩余量；
植人物初始量。
5.4.2.3按式(2)计算新骨生成率(RNBF)：RNBF(%)=NBFV/MCS×100%
式中：
新骨生成率；
新骨生成量；
植人物横截面积。
分别计算下列各项数据：
植人物降解率平均值；
每植人点松质骨内植人物外部、中部、内部的降解率的总和除以3。植人物降解率总平均值与标准差；b)
各植入点植入物降解率平均值的总和除以10。新骨生成率平均值：
每植入点松质骨内植入物外部、中部、内部的新骨生成率的总和除以3。d)
新骨生成率总平均值与标准差。各植人点新骨生成率平均值的总和除以10。3结果评价
根据试验样品和对照样品的降解率和新骨生成率数据，结合临床预期用途作出总体评价。6实验报告
实验报告应包括详细的数据资料，以能够对结果作出独立的评价。实验报告应注明检测机构和检测日期，应报告下列项目：
a）植入样品；
分别描述试验样品和对照样品的孔隙率、孔径大小、外形、尺寸和数量。选择对照材料的理由。
样品的处理过程：包括所采用的清洗、处理和灭菌技术。如果样品不是在本实验室制备，在检4
测开始之前，生产厂家应提供这些资料。b）动物与植入；
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动物的种属、品系、来源、年龄、性别和体重，检测期间的环境条件，动物饮食及动物状况，以及检测期间包括意外死亡在内的所有观察发现。一植人方法以及每个动物和每一部位植入物的数量。c）取样与组织学制备；
所采用的取样方法，记录每只动物、每一观察期植入物取到的数量，所有样品都应作为试验的一部分。
植人部位的大体观察，所采用的组织学切片制备技术。图像分析软件的名称和版本号。d）肉眼和显微镜观察；
每一植入物的观察情况以及植人物周围组织的大体外观。必要时。应包括引流淋巴结的观察。分别报告试验样品和对照样品的植入物降解率总平均值与标准差、新骨生成率总平均值与标准差及新骨成熟度。
e）结果评价。
报告应包括对植人后试验和对照材料局部生物学反应的综合及比较评价。YY/T0511-—2009
A.1试样固定
A.1.1固定液配置
附录A
（资料性附录）
不脱钙硬组织切片的样本制备
配置4%的中性甲醛溶液作为样本的固定液。A.1.2固定时间
通常固定3天～4天，然后用流水冲洗固定液。A.2样本脱水与透明
按表A.1要求，将样品依次置于不同体积浓度的乙醇溶液中去除样品中的水分，接着用二甲苯透明样本。
表A.1样本脱水与透明方法
包理液制备
甲基丙烯酸甲酯（MMA）包埋液
按下列步骤进行：
试剂浓度
70%乙醇
80%乙醇
90%乙醇
95%乙醇
无水乙醇
二甲苯
将60g氢氧化钾溶解于1200ml蒸馏水中：取400mlMMA液与上述氢氧化钾液混合3min，静置10min；同法重复2次；
加人400ml蒸馏水洗涤2次；
回收MMA液，加人50g无水硫酸铜；24h后过滤。
MMA预聚液
按下列步骤进行：
取103ml纯MMA液加入2g过氧化苯甲：置于56℃水浴20min，再置于冰水浴15min；可重复多次使MMA液略显黏稠；
一10℃保存。
注：预聚能缩短包埋时间，因此可根据需要采用预聚液或非预聚液。6
时间（h）
A.4样本包埋
采用MMA进行标本包埋并按下列步骤进行：1）用硅油处理包埋容器的内壁；YY/T0511—2009
2）在包埋容器内放置少量PMMA块，然后放人标本后，加人预聚或未预聚的MMA单体；3）抽真空4h～6h；
4）4℃冰箱内静置1周～2周；
5）常温下继续聚合直至硬化。
A.5切片
选定松质骨部位的组织，分别取外、中、内三个部位的组织切片。切片方向与植人物长轴垂直，采用锯式或其他类型切片机切片，所获得的切片包含植人物及周围组织。A.6贴片
按下列步骤进行：
切片磨平至光滑；
超声洗涤2min；
3）40℃烘箱烘干：
取有机载玻片一块，测量其厚度（A)；另取切片测量其厚度（B)；4）
5）于载玻片中心滴注一滴快干胶水(氰基丙烯酸酯)，放上切片；待干燥。
A.7磨片
按下列步骤进行：
测量粘贴切片后的载玻片厚度(C)，计算胶水厚度（E)：E=C一（A十B)；假设最终切片厚度为X，则应磨去的厚度（F)为：F=B十E+十X；2）
可先后用P320和P1200砂纸磨去Fμm。3）
A.8抛光
要求达到显微镜下观察切片表面无划痕即可。A.9染色
表A.2所列VANGIESON苦味酸品红染色方法适用于厚度50μm土5μm的切片。表A.2VANGIESON苦味酸品红染色方法步骤
0.1%甲酸
20%甲醇
Stevenol蓝染液
VanGieson苦味酸品红液
无水乙醇洗涤
时间（min）
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参考文献
[1]GB/T16886.12—2005医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品[2]
GB/T16886.14一2003医疗器械生物学评价第14部分：陶瓷降解产物的定性与定量[3J LU J.X, GALLUR A, FLAUTRE B, et al. Comparative study of tissue reactions to calciumphosphate ceramics among cancellous, cortical, and medullar bone sites in rabbits. J BiomedMater Res,1998,42.357—367
[4] FLAUTREB,ANSELME K,DELECOURT C,et al.Histological aspects in bone regenerationof an association with porous hydroxyapatite and bone marrow cells. J Mater Sci: Mater Med,1999,10.811-814
KOERTEN HK,VAN DER MEULEN J. Degradation of calcium phosphater ceramics. J Bi-omedMaterRes，1999,44.78-86
ISO 10993.6-2007 Biplogical evaluation of medical devices-part 6:Tests for local effects[6]
afterimplantation
ISO 10993-1:2003 Biological evaluation of medical devices part 1: Evaluation and testing[7]
ISO 10993-2:2006 Biological evaluation of medical devices part 2:Animal welfare requirement[9]
Qingyi Shen,Jiao Sun,Chemical dissolution and bone formation in identical porous β-TCP andHA，KeyEng.Materials，330-332(2007)35-38中华人民共和国医药
行业标准
多孔生物陶瓷体内降解和
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2011年5月第一版2011年5月第一次印刷*
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