【SN商检标准】 国境口岸斑点热群立克次体巢式PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4611—2016
国境口岸斑点热群立克次体
巢式PCR检测方法
Nested PCR detecting method for spotted fever grouprickettsiaeatfrontierport
2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
国境口岸斑点热群立克次体
巢式PCR检测方法
SN/T4611—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：(010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张0.5字数10千字
2017年11月第一次印刷
2017年11月第
印数1-—500
书号：155066·2-32308
定价14.00
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4611-2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承扭识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研究所。本标准主要起草人：翰文东、王艳梅、丁淑丽、程成、闫冀焕、徐宁、付维明、耿聪、孙毅、包力。1范围
国境口岸斑点热群立克次体
巢式PCR检测方法
SN/T4611-2016
本标准规定了国境口岸斑点热群立克次体的检验对象，方法、生物安全要求及结果判定本标准适用于国境口岸人、医学媒介生物（蜱、螨等）以及宿主动物中斑点热群立克次体的巢式PCR方法检测（除外R.helvetica、R.australis、R.bellii、R.canadensis4种立克次体）。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193基因检验实验室技术要求WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件：3.1
斑点热群立克次体spottedfevergrouprickettsiaeSFGR引起斑点热的一组病原体，可引起包括落矶山斑点热、钮扣热、北亚热、昆士兰斑点热、立克次体痘和口本红斑热在内的多种疾病，是天然寄生在螨和蜱体内并通过螨和蜱的可咬传播给人或动物的专性细胞性寄生菌。除个别的立克次体为螨传播外，其余均为蜱传播，具有明显的自然疫源性特征。主要媒介蜱包括：草原革蜱、边缘革蜱、森林革蜱、中华革蜱、嗜群血蜱、口本血蜱、长角血蜱、亚洲璃眼蜱4检测对象
4.1疑似感染斑点热群立克次体的受染嫌疑人的血液样本。4.2从出人境交通工具、集装箱及口岸地区等场所采集的似感染斑点热群立克次体的游离蜱及以上述场所宿主动物体表采集的寄生蜱。4.3出人境交通工具、集装箱及口岸地区等场所捕获的疑似感染斑点热群立克次体的宿主动物。5生物安全和PCR防污染要求
5.1检测工作中的个人防护参照GB19489执行5.2进行标本检测的实验室应符合GB19489生物安全二级实验室要求。5.3使用过的实验用品应按照GB19489规定对废弃物的处理要求进行无害化处理。1
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SN/T4611-2016
5.4PCR防污染措施按照WS/T230和SN/T1193的规定执行。6
仪器和耗材
本方法使用的主要仪器和设备如下：扩增仪；
生物安全柜；
高速台式离心机（最高离心力12000g以上）；台式离心机（最高离心力2000g以上）；漩涡振荡器：
恒温水浴锅；
高压灭菌锅：
低温冷藏、冷冻冰箱；
微量可调移液器（10L、100、200叫1000）及配套带滤芯吸头：Eppendorf管：
螺口塑料管。
7主要试剂
除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。核酸提取试剂：天根生化科技(北京)有限公司生产的细菌核酸提取试剂盒\。PCR反应试剂如下：
10XPCR缓冲液（Mg2+plus
dNTP(10 mmol/L);
Taq酶(5U/μL);
阴性对照品（灭菌双蒸水
阳性对照品（阳性的斑点热群立克次体e)
以上试剂也可由商品化试剂盒
7.4电泳缓冲液（10XTBE)制备方法如下免费标准bzxz.net
165g硼酸
称取108gTris碱，7.44gNaEDTA-H.O和解后加水定容至1L，室温保存，300mL的ddH，O中，充分搅拌溶
7.56XLoading缓冲液（EDTA30mM,Glycerol36%.XyleneCyanolFF0.035%Bromophenol0.05%）
7.6GoldView核酸染料：使用浓度为0.05μL/mL。8检测程序
样本的采集、运送及保存
8.1.1血液样本
采集宿主动物或人全血标本，应常规无菌采集EDTA抗凝的血液样本至少1mL，4℃保存。样本1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
TKAON KAca
SN/T4611-2016
运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。对于24h内不能立即检测的样本，一周内检测可保存于一20℃冰箱，如超过一周无法检测的样本应保存于一70℃及以下温度冰箱。8.1.2蜱及宿主动物组织样本
将采集的蜱直接装入2mL螺口塑料管内·成蜱独立分装，若蜱或幼蜱按10只一组分装，在管壁上做好编号，低温运输或一70℃以下保存待检。采集宿主动物组织脾或肾约50mg放入无菌螺口塑料管内，在管壁上标注好脏器名称及编号，低温运输或一70℃以下保存待检。8.2样本的前处理
8.2.1血液样本
血液样本3000g离心5min后，吸取血液白细胞层200μL提取DNA。8.2.2蜱及宿主动物样本
取蜱或者宿主动物组织，加人无菌生理盐水200L～300uL于研磨器中，研磨至匀浆状，4℃保存。
8.3样本的DNA提取
按照商品化试剂盒说明书进行。8.4PCR反应液配制
反应体系设置为50μL，组成见表1。表1PCR反应液配制表
10×PCR缓冲液（含氯化镁）
dNTP(10.mmol/L)
上游引物（20μmol/L）
下游引物（20μmol/L）
聚合酶（5U/mL）
双蒸水
依据上述反应体系配制待检样本、阳性对照品、阴性对照品的PCR检测反应液，并置于PCR反应管中。
8.5PCR扩增
8.5.1根据立克次体190kDa蛋白（rOmpA）设计引物，阳性标本可扩增出533bp的片段。引物序列如下：
外引物：
Forward primer
Reverse primer-2
5-ATGGCGAATATTTCTCCAAAA-3
5'-GTTCCGTTAATGGCAGCATCT-3'
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SN/T4611—2016
b）内引物：
5-ATGGCGAATATTTCTCCAAAA-3
Forward primer
5-AGTGCAGCATTGGCTCCCCCT-3
Reverse primer-l
8.5.2第一轮扩增：采用外引物对，扩增条件为94℃预变性5min，而后进行35个循环，条件为94℃变性1min.52℃退火1min.72℃延伸1min。最后72℃延伸5min。8.5.3第二轮扩增：采用内引物对，将第一轮扩增产物作为模板，扩增条件为94℃预变性5min，而后进行35个循环，条件为94℃变性1min，53℃退火1min.72℃延伸1min。最后72℃延伸5min。8.6电泳
取5uL扩增产物，加入1uL6XLaading缓冲液，混匀，加样于1.5%琼脂糖凝胶（含0.05μL/mlGoldView）胶孔中，以5V/cm稳定电压电泳30min，用凝胶成像系统观察是否出现目的条带（533bp）。8.7结果判定
8.7.1阳性
如阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小为533bp），则判定该样品斑点热群立克次体PCR检验阳性。如认为有必要进行确认或针对特殊样品，可进一步进行测序验证。
8.7.2阴性
如阴性对照和空白对照术出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小为533bp），而待测样品中末出现PCR扩增产物，则判断待测样品斑点热群立克次体PCR检验阴性。书号：155066·2-32308
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