【SN商检标准】 口岸食源性疾病腺病毒PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3307--2012
口岸食源性疾病腺病毒PCR检测方法PCR method of adenovirus for foodborne disease at frontier port2012-12-12发布
华人民共和国
国家质量蓝督检验检疫总扇
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—-20019给出的规则起草。SN/T3307—2012
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口，本标准起草单位：中华人民共和国大津出入境检验检疫局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：关淳、赵良娟、王乃福、曲鹏、黄晶晶、高旗利。T
1范围
口岸食源性疾病腺病毒PCR检测方法SN/T3307—2012
本标准规定了口岸食源性疾病腺病毒40型和41型PCR检测方法、结果判定及报告及生物安全措施。
本标准适用于检验检疫机构对口岸食源性疾病腺病毒40型和41型的检测和报告。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括解有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析试验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
adenovirus
腺病毒
属于腺病毒科，无包膜的双链INA病亚属，F亚属包括腺病毒40型和41型，称原体，病毒颗粒呈球形，直径70nm耐受范围较宽，对脂溶剂有较强的抵抗力4设备
基于生物和遗传特征，共有51个血清型，分属A~F6个为肠腺果
病毒，肠腺病毒是引起儿童食源性病毒腹泻的重要病am，病毒体呈类
似通讯卫量样结构。腺病毒对酸碱及温度的外线照射3
高速冷冻离心机：最大离心力13000g4.1
4.2PCR扩增仪。
4.3电泳仪。
4.4空气浴振荡摇床：200r/min。4.5凝胶成像系统。
56美.30min可被灭活。
可调移液器：0.1μL~2μL，1μ~10μ，20μL~100μ，100μL~1000。4.6
水浴锅。
低温冰箱：-20℃和-80℃。
勾浆器。
制冰机。
高压灭菌锅。
生物安全柜。
SN/T3307--2012
5主要试剂
除另有规定外，试剂为分析纯，实验用水均为灭菌双蒸水，规格符合GB/T6682一级水的要求。5.1TanDNA聚合酶。
5.2 dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP.5.3琼脂糖。
5.4限制性内切酶RscI。
5.5PEG8000溶液：16%PEC8000.0.3mo1/I.氯化钠。5.6句浆缓冲液：0.11nol/L磷酸氢二钠、0.3mol/I.氯化钠、pH9.6。5.7溴化乙锭。
5.8相对分子质量标准：50bpDVA[adder和100bpDNAladlder。5.9柱式病毒 DNA提取试剂盒。
5.10PCR产物纯化试剂盒，
5.11PBS缓冲液：pH7.4
5.12TE缓冲液：10mmol/LTrisHCl.1mmol/LEDrA.pH8.0。5.1310XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl.200mmol/LKCl.15mmol/LMgClzpI8.4。5. t4 5× TBE 电泳缓冲液:Tris 54 g、硼酸 27. 5 g,0. 5 mol/L EDTA 20 ml,加蒸馏水至 1 000 mL,pII8.0。使用时稀释为0.5×TI3E电泳缓冲液。5. 15 质控样品:用含腺病毒目的基因的质粒作为 PCR 的阳性对照;不含腺病毒月的基因的质粒为阴性对照。
5. 16 引物序列见表1。
表 1 腺病毒 PCR 扩增引物序列引物名称
正向引物
反向引物
引物序列(5°-3\）
5*-GCC GA GTG GTC TIA CAT GCC ACA GTC-3':5*-CAG CAC GEC GCG GAT GIC AAA GT-3'扩增片段大小
注：PCR引物核女酸序列采用与 Ad4及 Ad41六邻体基因商度保守区互补引物扩增腺病毒 DNA,6检测步骤
6.1样品处理
样品运输过程中保持温度在0℃～5℃。实验室接到样品后应尽快进行检测：如果暂时不能检测应将样品保存于一70℃冰箱中，避免样品的反复冻融。取可疑食品5名~-1多加人4ml.匀浆缓冲液中，匀浆器充分勾浆3min：将勾浆液置于37℃空气浴振荡播床中、200r/min振荡30min：4℃。12000g，离心10min。取10mL上清液转移到10ml离心管中，加入1.4mLPEG8000溶液，颠倒5次混列。冰上放置至少1h，4℃，12000g离心10min，弃上清液，保留沉淀.用丁腺病毒DNA提取。对于患者早期粪便和呕叶物取上清液.用PBS缓冲液10%稀释后，进行D)VA提取，6. 2腺病毒 DNA 的提取
用柱式 NA 提取试剂盒或传统酚-三氮中烧法提 DVA模板，前者按说明-书操作,后者参照2
KAoNiKAcabzxZ.net
附录A。将DNA模板溶于50μLTE缓冲液中，以备PCR检测，6.3PCK检测
SN/T 3307-2012
PCR反应液组成（总体积50μL):10×PCR缓冲液5μL,2mmal/LdNTPs5μL10μmol/I.上下游引物各2.5μL;TuDNA骤合酶2μL提取的DNA模板5l,无RNuse超纯水28uL。PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性40s.55℃邀火405，72℃延仲40s.共35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。
PCR检测时应具有阳性对照、阴性对照和试剂空白对照。使用不同型导扩增仪时，要对扩增条件进行优化。可使用等效的商品化试剂盒。6.4电泳观察结果
用0.5×TBE电泳缓冲液配制1.5%琼脂糖电泳凝胶并趁凝胶术凝固时加人溴化乙锭使其最终浓度达到1/mL制胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面没过胶面。将7.5μL扩增产物和6倍加样缓冲液1.5 μL.混合-点样,相对分子质量标准为参照,5 V/cm 恒压，电泳 30 min～40 min。紫外凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。扩增目的条带大小为301bp。6.5扩增产物的限制性内切酶分析按 PCR产物纯化试剂盒说明书操作，纯化 PCR扩增产物。取10 μI.PCR扩增产物加人限制性内切酶Ra12ul.酶切10×huffer2ul.超纯水μl,反应体积共20ul.置于37C水浴中4h。取10μl.酶切物进行琼脂糖电泳，相对分子质量标准为参照，凝胶成像系统观察。纯化的扩增产物经RsaI酶切后可清楚的将肠道腺病毒 40型和 41型区别开,腺病毒 40型被酶切为25 bp和 45bp两个片段，腺病毒 41 型被酶切为211 bp和 90 bp两个片段。7结果判定及报告
当阳性对照出现目的条带，阴性对照及试剂空白对照均末出现目的条带时，试验结果成立。被检样品未出现预期大小的扩增条带时，报告未检出食源性腺病毒。被检样品出现预期大小的扩增条带，应对扩增产物进行纯化后做限制性内切酶分析，扩增产物经酶切后得到与腺病毒40型或41型相同的片段时，则可判定检测结果阳性。根据结果判定，报告检出某型食源性腺病毒DVA片段，否则报告未检出食源性腺病毒。8安金防护
实验中使用的澳化乙锭具有致癌作用，应戴乳胶或PE手套进行操作。实验中产生的废弃物和器血应于121℃高压15min后再丢弃或进行清洗。9防污染措施
实验环境应符合SN/T1193的要求，检测过程中防污染措施按照SN/T1193中的规定执行。10生物安全措施
实验室设备和防护应符合GB194893
KAONKAca
SN/T 3307—2012
下列操作应在生物安全2级（BSI.-2)实验室或生物安全柜中进行：可能产生含病毒气溶胶的样品处理；一收集或浓缩病毒；
病毒DNA提取和扩增；
离心管和离心机转头的封闭和开启。irKAoNiKAca
附录A
（资料性附录）
酚-三氯甲烷DNA提取方法
SN/T3307—2012
A.1取400mLPBS缓冲液重悬的沉淀，加人10%SDS50μL，20mg/mL蛋白酶K5μL，混勾后于56℃保温30min。
A.2加人等体积酚：三氯甲烷：异戊醇（2524：1)，振荡混勺，12000g离心8min，将上层水相液移人另一离心管中。
A.3加入等体积的三氯甲烷导成醇（24：1振满混匀12000g离心8min，将上层水相移人另一离心管中。
LNnAe,2倍体积的顶冷无水乙醇，冰水浴中放置30min，12000g离心A.4加入1/10体积的3mol/L
15min，弃去上清液。
A.5用70%乙醇冲洗沉淀2次，自然干燥，50LTE落解S
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