【SN商检标准】 线虫传多面体病毒属病毒RT-PCR筛查方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4180—2015 线虫传多面体病毒属病毒 RT-PCR 筛查方法 Screening protocols for Nepovirus by universal RT-PCR 发布日期：2015-02-09 实施日期：2015-09-01 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、云南省烟草农业科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：林石明、廖富荣、方敦煌、吴媛、方志鹏、陈青、陈红运、黄蓬英、邓丛良。 引言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及本标准第 6.2 条与 ZL201110087903.4《一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用 RT-PCR 检测用简并引物、检测方法及其应用》相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，其愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可通过以下联系方式获得： 专利发明人：廖富荣、黄蓬英、林石明 专利权人：厦门出入境检验检疫技术中心 地址：福建省厦门市海沧区建港路 2165 号 邮编：361026 联系电话：0592-3269916 邮箱地址：lfro05163.com 请注意，除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 1 范围 本标准规定了线虫传多面体病毒属病毒的通用 RT-PCR 检测鉴定方法。本标准适用于寄主植物中线虫传多面体病毒的筛查检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 线虫传多面体病毒属基本信息 中文名称：线虫传多面体病毒属 学名：genus Nepovirus 属于小 RNA 病毒目（Picornavirales），伴生豇豆病毒科（Secoviridae），豇豆花叶病毒亚科（Comovirinae）。该病毒属包括南芥菜不花叶病毒（Arabis mosaic virus, ArMV）、桃丛簇花叶病毒（Peach rosette mosaic virus, PRMV）、烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus, TRSV）、番茄黑环病毒（Tomato black ring virus, TBRY）、番茄环斑病毒（Tomato ringspot virus, ToRSV）等重要的检疫性植物病毒。有关该病毒属的其他信息参见附录 A。 4 方法原理 以线虫传多面体病毒属病毒的基因组序列中的保守区域设计合成简并引物，建立该病毒属的通用 RT-PCR 检测方法；并对 PCR 产物进行序列测定，通过序列分析对病毒种类进行快速鉴定。因此，线虫传多面体病毒属的分子生物学特征是制定本检测鉴定方法的主要依据。 5 仪器设备与试剂 5.1 主要仪器设备与用具 主要使用以下仪器设备：研磨仪、微量天平（感量：0.001g）、PCR 仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH 计、各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL）等。 5.2 主要试剂 主要试剂见附录 B。 6 检测和鉴定 6.1 抽样检查 按照 SN/T 2122 给出的方法进行抽样、取样。 6.2 通用 RT-PCR 检测方法 按附录 B 给出的方法，进行通用 RT-PCR 检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。 6.3 序列测定和分析 将 PCR 产物回收后，进行克隆、测序，或者 PCR 产物直接测序（序列测定可由专业的生物公司完成）。把测定的核苷酸序列及翻译后的氨基酸序列与已知线虫传多面体病毒属的病毒序列进行比对。注：序列比对可利用 NCBI 网站上的 BLAST 软件进行，网址为 http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。 7 结果判定 7.1 如果通用 RT-PCR 方法检测结果为阴性，则判定未检出线虫传多面体病毒属病毒。 7.2 如果通用 RT-PCR 方法检测结果为阳性，则进行序列测定与分析： 如果翻译后氨基酸序列与线虫传...