【SN商检标准】 黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4405—2015 黄瓜花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Cucumber mosaic virus 发布日期：2015-12-04 实施日期：2016-07-01 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：郑耘、卢小雨、张伟锋、向才玉、王红英、龙海、潘广、胡运发、李彬、孔德英。 1 范围 本标准规定了黄瓜花叶病毒的生物学测定、血清学检测、免疫电镜、RT-PCR 检疫鉴定方法，本标准适用于进出境植物种子、苗木等繁殖材料和植物产品中黄瓜花叶病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 基本信息 学名：Cucumber mosaic virus 缩写：CMV 分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）；黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）。其他信息参见附录 A。 4 原理和方法 依据 CMV 鉴别寄主的症状、病毒形态、免疫学特性及分子生物学特性进行检测判定。 5 仪器设备、用具及设施 5.1 仪器设备 天平（感量 1/10000g）、pH 计、酶标仪、透射电子显微镜、PCR 仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、高速离心机、超低温冰箱等。 5.2 用具 微量移液器、研钵、离心管、花盆、消毒土等。 5.3 设施 植物隔离检疫温室。 6 试剂 DAS-ELISA 检测试剂（见附录 B）、RT-PCR 检测试剂（见附录 C）、生物学测定试剂（见 8.4）。免疫电镜检测试剂按照 SN/T 1840 的规定执行。 7 样品制备 7.1 种子类 抽样按照 SN/T 2122 的规定执行。将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于 25℃ 左右生长并进行症状观察。待长出 3 片～4 片真叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10 株为 1 组）并编号。 7.2 苗木类 抽样按 SN/T 2122 规定抽样。将苗木种植于隔离温室中，于 25℃ 左右生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法同 7.1。 8 检测方法 8.1 DAS-ELISA 检测 方法见附录 B。 8.2 免疫电镜检测 按照 SN/T 1840 的规定执行。 8.3 RT-PCR 检测 方法见附录 C。 8.4 生物学测定 8.4.1 接种 病叶加 1:1（质量:体积）的磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L, pH 7.2）于研钵中充分研碎，在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土，用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面。 8.4.2 鉴别寄主症状 - 宽色藜 (Chenopodium amaranticolor)：褪绿或坏死斑，无系统症状。 - 黄瓜 (Cucumis sativus)：绿色或黄绿色系统花叶。 - 昆诺藜 (Chenopodium quinoa)：褪绿或坏死斑，无系统症状。 - 番茄 (Lycopersicon esculentum)：系统花叶，叶片变窄。 - 克利夫兰烟 (Nicotiana clevelandii)：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成绿色或黄绿色系统花叶或环斑。 - 心叶烟 (Nicotiana glutinosa)：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成绿色或黄绿色系统花叶或环斑。 - 烟草 (Nicotiana tabacum)：接种叶无症状，或形成褪绿斑或坏死斑；也可能形成系统花叶或畸形。 - 菜豆 (Phaseolus vulgaris)：冬季表现细小的坏死斑，但夏季无症状表现；无系统症状。 9 结果判定 DAS-ELISA 检测为阳性后，RT-PCR 或免疫电镜检测结果为阳性，可判定检出黄瓜花叶病毒。如果上述方法还不能判定检测结果，可进行生物学测定，并进行复验。若 DAS-ELISA 检测为阴性，则判定为未检出该病毒。 10 样品和记录保存 10.1 样品保存 经检测确定携带 CMV 的样品在合适的条件下保存。种子保存在 4℃，病株在 -20℃ 或者 -70℃ 冰箱中保存，提取的 RNA 样品若需长期保存应放