【SN商检标准】 竹花叶病毒的检疫鉴定方法

SN/T 4406—2015 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 竹花叶病毒的检疫鉴定方法 Detection and identification of Bamboo mosaic virus 发布日期：2015-12-04 实施日期：2016-07-01 国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。 本标准主要起草人：沈建国、廖富荣、蔡伟、林双庆、陈雅菁、李敏、张永江、金晶、高芳銮、吴祖建。 1 范围 本标准规定了竹花叶病毒检测的程序和方法，适用于进出境竹子上竹花叶病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 原理 中文名称：竹花叶病毒 学名：Bamboo mosaic virus 缩写：BaMV 分类地位：线形病毒科（Alphaflexiviridae），马铃薯X病毒属（Potyvirus）。 竹花叶病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。竹花叶病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附录A。 4 仪器设备、用具及试剂 4.1 仪器设备 高速冷冻离心机、PCR仪、酶标仪、胶成像分析系统等。 4.2 用具 各种量程的可调移液器（100 $\mu$L、200 $\mu$L、1000 $\mu$L）、离心管（1.5 mL）、研钵等。 4.3 试剂 间接ELISA试剂见附录B、RT-PCR试剂见附录C。 5 检测与鉴定 5.1 抽样 抽样方法按照SN/T 2122中规定执行。 5.2 间接ELISA 具体方法见附录B。 5.3 RT-PCR 具体方法见附录C。 6 结果判定与记录 6.1 结果判定 当间接ELISA检测结果为阳性，且RT-PCR检测结果为阳性时，则判定为检出BaMV，否则判定为未检出BaMV。 当RT-PCR检测结果呈阳性，且测定的序列为BaMV序列，则判定为检出BaMV，否则判定为未检出BaMV。 6.2 结果记录 记录各项实验数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。血清学检测结果保留吸光值的数据报告，分子生物学检测结果保留电泳照片，序列测定结果保留测序报告图。 7 样品的保存 经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-80℃超低温冰箱中，并作好登记和标记工作，以备复核用。 附录A（资料性附录） 竹花叶病毒的背景资料 A.1 寄主范围 已报道的自然寄主为竹子，包括绿竹、蓬莱竹、长枝竹、泰山竹、麻竹、孟宗竹、箭竹等。 A.2 病害症状 BaMV侵染竹子均为系统性感染，一般在叶片引起黄化或褐化的条斑症状，以嫩叶上尤为明显。在竹笋与竹茎横剖面上可观察到褐色到黑色的斑点，上下延伸后在纵剖面上则呈现短钉状病斑，导致竹笋组织硬化。感病后期或数年后，造成竹笋产量显著减少。 A.3 分布地区 主要分布于中国台湾、巴西、澳大利亚及夏威夷。 A.4 传播途径 主要通过机械传播。可通过带毒竹子种苗进行远距离传播。 A.5 粒体形态 病毒粒体为长丝状，大小约490 nm $\times$ 15 nm。 A.6 病毒基因组 基因组为正义单链RNA，全长约6366 bp。 附录B（规范性附录） 间接ELISA B.1 试剂 B.1.1 包被缓冲液（pH 9.6） 成分：碳酸钠 (Na2CO3) 2.93g、碳酸氢钠 (NaHCO3) 0.2g、叠氮化钠 (NaN3) 0.2g。 配制方法：加入蒸馏水900mL，用HCl调节pH值到9.6，然后加蒸馏水至1L，4℃储存。 B.1.2 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4） 成分：氯化钠 (NaCl) 8.0g、磷酸二氢钾 (KH2PO4) 0.2g、磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 1.15g、氯化钾 (KCl) 0.2g、叠氮化钠 (NaN3) 0.2g。 配制方法：加入900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HCl调节pH值到7.4，然后加蒸馏水至1L。