【SN商检标准】 竹花叶病毒的检疫鉴定方法

SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4406—2015
竹花叶病毒的检疫鉴定方法
Detection and identificationof Bamboo mosaic virus2015-12-04发布
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中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4406—2015
本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。本标准主要起草人：沈建国、廖富荣、蔡伟、林双庆、陈雅菁、李敏、张永江、金晶、高芳銮、吴祖建。I
1范围
竹花叶病毒的检疫鉴定方法
本标准规定了竹花叶病毒检测的程序和方法，本标准适用于进出境竹子上竹花叶病毒的检测。2规范性引用文件
SN/T4406—2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3原理
中文名称：竹花叶病毒
学名：Bamboomosaicvirus
S.缩写：BaMV
分类地位：线形病毒科（Alphafleriviridae），马铃薯X病毒属（Potervirus）。竹花叶病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。竹花叶病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附录A。4
仪器设备、用具及试剂
4.1
仪器设备
高速冷冻离心机、PCR仪、酶标仪、4.2用具
胶成像分析系统等
各种量程的可调移液器（1000pL、200离心管（1.5mL）、研钵等。
4.3试剂
100μL、2
间接ELISA试剂见附录B、RT-PCR试剂见附录C。5检测与鉴定
5.1抽样
抽样方法按照SN/T2122中规定执行。5.2
间接ELISA
具体方法见附录B。
μl1oμL、2μL）、PCR反应管、Eppendorf1
SN/T4406—2015
5.3
6
RT-PCR
具体方法见附录C。
结果判定与记录
6.1
结果判定
结果判定如下：
当间接ELISA检测结果为阳性，且RT-PCR检测结果为阳性时，则判定为检出BaMV，否则判定为未检出BaMV。
当RT-PCR检测结果呈阳性，且测定的序列为BaMV序列，则判定为检出BaMV,否则判定为未检出BaMV。
6.2
2结果记录
记录各项实验数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。血清学检测结果保留吸光值的数据报告，分子生物学检测结果保留电泳照片，序列测定结果保留测序报告图。
样品的保存
经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在一80℃超低温冰箱中，并作好登记和标记工作，以备复核用。
2
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
竹花叶病毒的背景资料
SN/T4406—2015
已报道的自然寄主为竹子，包括绿竹、蓬莱竹、长枝竹、泰山竹、麻竹、孟宗竹、箭竹等。A.2
病害症状
BaMV侵染竹子均为系统性感染，一般在叶片引起黄化或褐化的条斑症状，以嫩叶上尤为明显，在竹笋与竹茎横剖面上可观察到褐色到黑色的斑点，上下延伸后在纵剖面上则呈现短钉状病斑，导致竹笋组织硬化，感病后期或数年后，造成竹笋产量显著减少。分布地区
A.3
主要分布于中国台湾、巴西、澳大利亚及夏威夷。传播途径
A.4
主要通过机械传播。可通过带毒竹子种苗进行远距离传播。A.5
5粒体形态
病毒粒体为长丝状，大小约490nm×15nm，如图A.1。图A.1BaMV病毒粒体（LapierreH和SignoretP，2004）A.6病毒基因组
基因组为正义单链RNA，全长约6366bp。3
SN/T4406—2015
B.1试剂
B.1.1
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（Na2CO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaNs）
附录B
（规范性附录）
间接ELISA
2.93g
0.2g
加人蒸馏水900mL，用HCI调节pH值到9.6，然后加蒸馏水至1L，4℃储存。B.1.2
磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）
氯化钠(NaCI)
磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢二钠（NazHPO,）
氯化钾（KCI)
叠氮化钠（NaN3）
8.0g
0.2g
1.15g
0.2g
0.2g
加人900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HC/调节pH值到7.4，然后加水至1L。B.1.3
PBST
每升PBS中加人0.5mL的吐温
B.1.4
酶标抗体稀释缓冲液
1XPBST缓冲液
牛血清白蛋白（BSA）
聚乙烯基吡咯烷酮(PVP）
叠氮钠(NaN）
20。
800.0ml
2.0g
20.0g
2
用蒸馏水定容至1L，4℃条件下贮存。底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）
B.1.5
氯化镁（MgCl2）
叠氮化钠（NaN）
二乙醇胺
0.1g
0.2g
97.0mL
溶于800mL蒸馏水中，用HCl调pH值至9.8，蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.1.6抗体
病毒抗体：BaMV抗体。
酶标抗体：碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG。4
B.2程序
B.2.1样品制备
SN/T4406—2015
称取0.5g～1.0g待测样品，按1：10（质量：体积）比例加人包被缓冲液，用研钵研磨成浆，8000r/min离心5min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按说明书进行。
B.2.2包被抗原
加入制备好的检测样品，同时设备阴性对照、阳性对照和空白对照。每个处理至少设2个重复。
100μL/孔，37℃孵育1h或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，用PPBST洗涤4次～6次。
B.2.3加病毒抗体
将病毒抗体按说明稀释至工作浓度，加人到酶联板的孔中，100μL/孔，37℃孵育1h，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次～6次。B.2.4加酶标抗体
农度，加人到酶联板的孔中，100μL将酶标抗体按说明将稀释至工作浓板孔中溶液，用PBST洗涤4次6次。B.2.5加底物
孔，37℃孵育1h，倒去酶联
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用）按100μL/孔，加人到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.6吸光值的测定
用酶联仪在405nm处读OD值
B.3结果判断
在满足阴性对照孔的OD40s值<0.15阳性对照孔的OD405值/阴性对照孔的OD405值>5～10，孔的重复性基本一致的质量要求：
样品ODaos值/阴性对照OD4os值>2，判为阳性。样品OD4o5值/阴性对照OD405值<2，判为阴性。样品OD405值/阴性对照OD405值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。
5
SN/T4406—2015
C.1试剂
C.1.1TRIzol裂解液
25×TBE缓冲液
C.1.2
Tris碱
硼酸（HBO）
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测方法
54.0g
27.5g
20mL
补充蒸馏水至1L。用时加蒸馏水稀释至0.5×TBE36×加样缓冲液
C.1.3
0.25%溴酚蓝
40%（质量：体积）蔗糖水溶液。C.1.4RNA提取试剂
TrizoL、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC(焦碳酸二乙酯）处理过的ddH,O。5RT-PCR试剂
C.1.5
RT缓冲液、dNTPs(10ommol/L）、M-MLVRT（20oU/μL）、RNasin（40U/μL）、TaqDNA聚合酶(5U/μL)、PCR缓冲液、MgClz（25mmol/L）。C.2
引物序列
根据已报道的BaMV基因序列设计一对用于特异性扩增的引物上游引物BaMVf：5'-TCTGGAACTGGAACGGGAACT-3上游引物BaMVr：5'-GATTGTCTAATGGCGAACGTC-3RT-PCR产物大小437bp。
总RNA提取
c.3
取0.05g～0.1g样品组织置于研钵中，液氮研细，加人1mLTRIzol试剂充分研磨，15℃～30℃下静置5min；4℃，12000r/min离心10min，取上清；加入氯仿300μL，剧烈震荡15s，室温静置5min，4℃，12000r/min离心15min，取上层水相；加人等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置15min，4℃，12000r/min离心10min，弃上清；加人1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次，每次4℃，7500r/min离心3min，弃上清；RNA沉淀干燥后，用20μL～40μL经DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的ddHz0溶解，一80℃保存备用。注：RNA提取也可用商业化的试剂盒。6
C.4cDNA合成
SN/T4406—2015
在PCR管中加人3μL总RNA，1μL下游引物BaMVr（10μmol/L），ddHO（DEPC处理）4μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加人下列试剂：5×RT缓冲液2.5μL、dNTPs（10mmol/L)1μL、M-MLVRT（200U/μL)0.5μL、RNasin（40U/μL)0.5μL。42℃水浴60min，70℃水浴10min，自然冷却至室温，一20℃保存备用。c.5
PCR扩增
PCR反应体系见表C.1，每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照。PCR反应条件：94℃预变性3min，然后94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸1min，35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min。PCR反应体系
表C.1www.bzxz.net
试剂名称
cDNA
TaqDNA聚合酶（5U/μL）
dNTPs(10mmol/L)
10×PCR缓冲液（Mg+Free）
25mmol/LMgCl2
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10 μmol/L）
ddH.0
总体积
加样量/μL
2.0
0.5
0.5
2.5
2.0
1.0
1.0
15.5
25.0
注：RT-PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整，也可采用商业化的一步或两步法试剂盒。C.6
琼脂糖凝胶电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳，电压120V，缓冲液0.5×TBE。电泳结束后染色，再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍照并做记录。.7
结果判断
如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定为阳性。
如果阳性对照、阴性对照和空白对照正常，待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定为阴性。

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