【SN商检标准】 食源性病原微生物实时PCR检测通用要求

SN/T 4090—2015 食源性病原微生物实时PCR检测 通用要求 Real-time polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - General requirements (ISO 22119:2011, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Real-time polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens General requirements and definitions, MOD) 国家质量监督检验检疫总局 2015-02-09 发布 2015-09-01 实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。SN/T 4090—2015 本标准修改采用ISO 22119:2011《食品和动物饲料微生物学实时PCR法检测食品致病菌的通用要求和定义》制定。与ISO 22119相比，本标准做了如下修改：对前言进行了修改，删去了引言部分；对规范性引用文件的描述按照GB/T 1.1的要求进行了修改；将标准中引用的国际标准用相应的国家标准或行业标准代替，如用SN/T 2102.1代替ISO 22174；将标准中的3.9、3.10和3.11中的注释部分作为资料性附录分别放在了附录A、附录B和附录C中。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国河南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：苗丽、李辑、杨娜、钱成、郑皓、张巨洲、张子宏、王艳、王珊。 1 范围 本标准规定了用聚合酶链式反应（PCR）方法从食品中检测或分离食源性病原微生物的通用要求，也阐述了通过实时PCR扩增和检测核酸序列（DNA及RNA反转录后得到的cDNA）的要求。本标准中的最低要求是同一实验室的样品具有可重复性，不同实验室间的试验结果具有可比较性。本标准适用于环境样品和动物饲料中食源性病原微生物的检测。注：由于该领域发展迅速，本标准中所举例子是标准起草阶段使用最频繁的案例。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2102.1 食源性病原体PCR检测技术规范 第1部分：通用要求和定义 SN/T 2102.3 食源性病原体PCR检测技术规范 第3部分：定性检测方法样品制备的要求 SN/T 2102.4 食源性病原体PCR检测技术规范 第4部分：定性检测方法扩增和检测要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时聚合酶链式反应，即实时PCR (Real-time PCR)：在酶的参与下，特定的DNA序列通过变性、与特定引物的退火和延伸等一系列步骤完成体外扩增并实时监测PCR产物的过程。 注1：通常，扩增反应混合物中包含有一个或多个特异性的DNA探针。同时，这些探针结合有一种或多种荧光染料。运用这种技术，探针与靶核酸序列特异性杂交后，激发出具有一定波长的光，从而产生荧光信号。 注2：对于用SN/T 2102.4方法已经确认阳性结果的样品，可用非特异性DNA荧光染料进行检测。 3.2 PCR产物 (PCR product)：PCR扩增出的DNA。 3.3 荧光共振能量转移 (FRET, fluorescence resonance energy transfer)：运用PCR检测食源性病原微生物时，在一定波长电磁辐射的激发下，能量从供体分子向受体分子转移，从而使受体分子的荧光强度提高。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关。 3.4 报告基团 (reporter)：运用PCR检测食源性病原微生物时，在适当波长的电磁辐射的激发下，用于测定杂交过程中特异性探针的荧光分子。 3.5 灭基团 (quencher)：运用PCR检测食源性病原微生物时，充当能量受体，从而淬灭报告基团信号的荧光分子。 3.6 非荧光灭基团 (dark quencher)：发出的能量不在光谱范围内，不能通过PCR仪的光谱检测系统检测到的受体分子。 3.7 5'-3'-核酸外切酶活性 (5'-3'-exonuclease activity)：有一类酶，如核酸聚合酶，具有将杂交的核酸分子沿5'-3'方向切开的功能。注：5'-3'-核酸外切酶的活性仅针对双链DNA结构，它取决于酶的种类，可以出现在Taq聚合酶、Tth聚合酶和Tfl聚合酶中。 3.8 荧光探针