【SN商检标准】 基因条形码筛查方法第9部分:检疫性腥黑粉菌

SN/T4877.9—2017 基因条形码筛查方法 第9部分：检疫性腥黑粉菌 DNA barcoding screening method—Part 9: Quarantine Tilletia 2017-08-29发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 2018-04-01实施 前言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；第2部分：检疫性黄单胞菌；第3部分：检疫性植原体；第4部分：检疫性茎点霉；第5部分：检疫性拟茎点霉；第6部分：检疫性嗜酸菌；第7部分：检疫性轮枝菌；第8部分：检疫性炭疽菌；第9部分：检疫性腥黑粉菌；第10部分：检疫性疫霉。 本部分为SN/T4877的第9部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：程颖慧、章桂明、王颖、高瑞芳、汪莹、潘广、向才玉、冯建军、史亚千、王红英、谢晓露。 1 范围 SN/T4877的本部分规定了小麦印度腥黑穗病菌（Tilletia indica）和小麦矮化腥黑穗病菌（Tilletia controversa）的DNA条形码筛查方法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18085 植物检疫 小麦矮化腥黑穗病检疫鉴定方法 GB/T 28080 小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 DNA barcode DNA条形码 生物体内能够代表该物种的标准、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.2 ITS internal transcribed spacer 内部间隔转录区序列 在真核生物中，核糖体DNA由核糖体基因及依次为：外部转录间隔区、18S基因、内部转录间隔区1（ITS1）、18S rDNA、内部转录间隔区2（ITS2）、28S rDNA和28S基因之间的间隔序列组成，其基因组序列从5'到3'与之相邻的间隔区组成。ITS1和ITS2作为非编码区，受外界环境的影响较小。与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。 4 检疫性腥黑粉菌的基本信息 英文名：Quarantine Bunt 学名：Tilletia indica，中文名：小麦印度腥黑穗病菌 学名：Tilletia controversa，中文名：小麦矮化腥黑穗病菌 分类学地位：真菌界（Fungi）、担子菌门（Basidiomycota）、黑粉菌纲（Ustomycetes）、黑粉菌目（Ustilaginales）、腥黑粉菌科（Tilletiaceae）、腥黑粉菌属（Tilletia） 5 方法原理 利用ITS片段作为检疫性病菌的条形码基因，通过对检测对象的DNA进行PCR扩增及产物测序后，利用生物条形码数据（BOLD）或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库比对，根据序列相似度筛查物种。 6 仪器设备和试剂 6.1 仪器设备 超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、-20℃低温冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器。 6.2 试剂 氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、70%乙醇、无水乙醇、Tris、饱和酚、Taq DNA聚合酶、明胶、溴化乙锭、DNA片段标记物、DNA裂解液、PCR缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、全基因组扩增试剂盒。 7 筛查鉴定方法 7.1 DNA制备 DNA制备方法见附录A。 7.2 DNA条形码基因片段扩增 利用通用引物进行ITS片段序列扩增，具体步骤见附录B。 7.3 序列分析 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，比对峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，去除两段测序质量Q值小于20的序列，然后在生物条形码数据（BOLD）数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库进行比对。