【行业标准】 出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型SPA基因分型方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4453—2016
出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型SPA基因分型方法
Molecular typing method of Staphylococcus aureus in export food-SPAtypingmethod
2016-03-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-10-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4453-2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局
本标准主要起草人：赵芳、洪小柳、刘慧玲、黄李华、吕敬章、葛丽雅、张恒、马淑棉、黄欣迪、蒋原、薛峰、闫笑梅、张炊
1范围
出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型SPA基因分型方法
本标准规定了金黄色葡萄球菌的SPA基因分型方法本标准适用于金黄色葡萄球菌的SPA基因分型2规范性引用文件
SN/T4453—2016
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.10食品安全国家标准
食品微生物学检验
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求金黄色葡萄球菌检验
GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CTAB十六烷基三甲基溴化铵（HexadecyltrimethylammoniumBromide）DNA脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid)dNTP
4原理
脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy
ribonucleosid
triphosphate)
乙二胺四乙酸（ethylenedi
aminetetraacetic
聚合酶链反应（polym
action
十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate)葡萄球菌A蛋白（StaphytococcusproteinA）酶DNA聚合酶
三（羟甲基）氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane）SPA是葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，绝大多数金黄色葡萄球菌均含有SPA。编码SPA基因的X区包含有2个～15个长21bp～27bP的重复序列，该区由于重复序列数目、重复序列特征及重复序列的排列顺序不同而具有高度的多态性。SPA基因的X区具有良好的重复性和体内、体外稳定性，适合用来基因分型。根据SPA基因序列设计引物对X区进行扩增，将扩增产物的测序结果进行比对分析，从而达到分型的目的。
5试剂和材料
除另有规定外，所有试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用1
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无DNA酶污染的容器分装。
5.1DNA提取试剂：称取0.1gchelex100粉末，加人100mL灭菌蒸馏水，摇匀即可。5.2RNase核糖核酸酶）溶液（20mg/mL）5.3
葡萄球菌溶菌酶溶液（1mg/mL）。TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。5.4
蛋白酶k溶液（25mg/mL）。
NaCl(氯化钠）溶液（5mol/L）。三氯甲烷（氯仿）。
异戊醇。
异丙醇。
10XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.0），200mmol/L氯化钾。琼脂糖。
DNA分子量标记物（100bp~-1000bp）血琼脂平板：见A.3。
CTAB-NaCI溶液：见A.I。
无菌生理盐水：见A.2。
仪器和设备
PCR仪。
DNA测序仪。
电泳装置。
凝胶成像系统。
电热仪。
离心机：离心力不小于12.000g。6.6
恒温培养箱：36℃±2℃。
移液器：2μL~10μ，10μ~100、20μ~200μ100gL~1000uL6.8
7检测步骤
7.1样品制备、增菌培养和分离
样品的制备、增菌培养和分离步骤参照GB4789.10方法进行。7.2
模版DNA的制备
7.2.1直接提取法
金黄色葡萄球菌经培养后，取增菌液1mL，加到1.5mL无菌离心管中，13000r/min离心5min，吸弃上清：加人50μLDNA提取液，混匀后沸水浴5min，13000r/min离心5min，取上清保存于一20℃备用以待检测。对分离到的菌落，可直接挑取加入50uLDNA提取液，再按照上述步骤制备模版DNA以待检测。
7.2.2CTAB法
金黄色葡萄球菌在血平板上36℃过夜培养后，挑取菌落用无菌生理盐水比浊到0.5麦氏单位；2
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13000r/min离心5min，吸弃上清：加人280uLTE缓冲液、2.5μLRNase和50μL的葡萄球菌溶菌酶.36℃温育1h；加人30μL10%SDS、2.5uLRNase和4μL蛋白酶k，36℃温育1h；加人100μLNaCl溶液和80μLCTAB-NaCI溶液，65C温育10min；加入等体积的氟仿混匀，13000r/min离心5min；将上层液转移到新的管中，等体积的酚：氯仿异戊醇（体积比为：25：24：1)抽提两次，随后等体积氯仿：异戊醇（体积比为：24：1)抽提一次：吸取上层液到新管中，加人500μL异丙醇沉淀DNA室温放置20min，13000r/min离心10min，吸弃上清液：加人1ml.70%乙醇溶液，13000r/min离心5min，吸弃上清，加人50μlTE缓冲液溶解DNA，立即使用或保存于一20℃冰箱备用。也可使用等效的商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模版DNA。7.3PCR扩增
7.3.1PCR扩增和测序引物序列
正向引物：5-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3；反向引物：5CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-32PCR反应体系
见表1。
表1PCR反应体系
双蒸水
10XPCR缓冲液
上游引物
下游引物
Taq醇
模板DNA
备液浓度
25mmol/L
2.5mmol/l.
10μmol/L
10umol/L
5U/μL
加样体积/rL
补至50
注1：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。注2：每个反应体系应设置两个平行反应。7.3.3反应条件
终浓度
1.5mmol/L.
0.18mmol/L
0.04μmol/L
0.04μmol/L
0.05U/μL
94℃预变性5min;94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环72℃延伸10min4℃保存反应产物。
注：PCR反应参数也可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。7.4电泳及DNA测序
制备1.5%～2%的琼脂糖凝胶，取5uL~15uLPCR扩增产物，分别和2μL上样缓冲液混合，进行点样，用DNA分子量标记物做参照，100V恒压电泳，电泳20min~40min，使用凝胶成像系统观察结果。观察到单一条带的PCR扩增产物，用相应测序引物进行双向测序。3
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7.5SPA基因型的确定
对测序结果进行比对分析，截取SPA基因重复序列区域，通过SPA基因分别数据库得到重复单元的编号和SPA基因型，见附录B。8
防止污染及生物安全的措施
参照GB/T27403和GB19489中的有关规定执行。结果与报告
通过对测序结果进行比对分析，并根据SPA基因分型数据库（httP：//ridom.de/spaserver/）的分型结果，报告金黄色葡萄球菌的SPA基因型S
CTAB-NaCI溶液
氯化钠
1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)
0.5mol/LEDTA
A.1.2制法
附录AbZxz.net
（规范性附录）
相关试剂
先用70mL蒸馏水溶解，再定容至200mL.121醇（400μ），摇匀，
2无菌生理盐水
氯化钠
蒸馏水
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灭菌15min。冷却后加人0.2%~1%2-硫基乙8.5g
称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中.121℃高压灭菌15minA.3
血琼脂平板
豆粉琼脂（pH7.4~7.6）
脱纤维羊血(或血)
5.0mL~-100mL
加热融化琼脂，冷却至50℃，以无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板5
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附录B
（规范性附录）
DNA序列分析和SPA基因分型步骤B.1SPA基因重复序列区域5端的标志序列为RCAMCAAAA（与重复序列的5'端起始相距0bp），3端的标志序列为TAYATGTCGT（与重复序列的3端末尾相距19bp或18bp）。按上述规则截取SPA基因重复序列区域，并按照24bp分割成不同的重复单元。B.2登陆官方网站http：//ridom.de/spaserver/，将每个重复单元的序列粘贴到页面下方“Search fora spa-typeorrepeat：\后的文本框中，点击search，即得到该重复单元的编号。按5”→+3的顺序依次确定每一个重复单元的编号。B.3上述步骤完成后，将所有重复单元的编号（5→3的顺序）依次输入文本框中，点击search，得到该菌株的SPA基因型。
注意：输人时去掉每个重复单元编号前的“\”B.4如果在搜索重复单元的编号或是SPA基因型别时发现是新型，可向官方网站数据库进行提交序列及峰图进行确认，获取新的SPA基因型别编号。
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