【国家标准】 马病毒性动脉炎诊断技术

ICS 11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 27980—2011
马病毒性动脉炎诊断技术
Diagnostic techniques for equine viral arteritis2011-12-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2012-06-01实施
本标准按照GB/T 1. 1---2009 给出的规则起草,本标握出中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位：农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室。本标准主要起草人：张念祖、杨仕标、宋建领、杜健、王金葬、朱建波、李华春。TTKANYKACA
GB/F27980—2011
1范围
马病毒性动脉炎诊断技术
本标雄规定了马病毒性动脉炎诊断技术。GB/T27980—2011
本标准适于马病毒性动脉炎的诊断和检疫。其中病毒分离，琼脂糖凝胶免疫扩散试验，反转录骤合酶链式反应试验适用于马病毒性动脉炎的病原诊断，中和试验和醉联免疫吸附试验适用于马病荐性动脉炭的抗体检测。
2临床诊断
2.1流行病学
马病毒性动脉炎是由马动脉炎病毒所引起的一种马的散发性呼吸系统和髂殖系统的接触性传染病，该病只感染马属动物，主要是通过生殖系统和呼吸系统而感染传播。公马带毒后无明显临床症状，却是危险的传染源，长期带毒的种公马可通过自然交配或人工授精的方式把病毒传给母马。流产马的盘、眙被、胎儿亦可传播本病：患病马在急性期通过呼啦道分泌物将病毒传给同样马或与其相接触的马。通过用具、饲料租饲养人员的接触也能将病毒传给易感马。该病呈世界性分布，血清学试验证实，我国也存在该病。
2.2临床症状
虑马可表现为临诊症状和亚临诊症状，大多数自然感染的马表现为亚临诊症状。试验感染潜伏期为 1d~6 d,野外感染普遍为 3 d--4 d。本病的典型症状是发热，-般感染后3 d14d体温升高达41℃，并可持续5d～9d。表现厌食、精神沉郁、四肢严重水肿，步伐僵直，眼、鼻分秘物增如,后期为性粘液，发生鼻爽和结膜炎，面部、颈部，停部形成皮肤渗块。公马的阴衰和包皮水肝，马驹和壁弱的马可引超死亡。怀孕母马流产，其流产率可达90%以上。流产发生在感染后的10d～30d，通常出现在临诊发病期或恢复早期。胎儿常在流产前就死亡，流产胎儿水肿，呼吸道粘膜和脾被膜上有山血点。母马痣愈后很少带，而大多教公复后则成为释毒的长期操带者。这些状并不是在同一马群中同时出现。马驹、老龄雌马和营葬状况差的马，临床症状较重，孕马比空怀母马明显。除极少数患马发生死亡外，一般为轻度临床症状。
2.3病理变化
死亡病例最去要的检变化是全穿较小动脉管内航层细胞的坏死，内膜上皮的病变导致特征性的出血和水肿以及血栓形成和梗死。常见大叶性肺炭和胸膜出物,发生全身性动脉炭的结果,所有浆膜和粘膜以及肺和中瞩等都有点状出血。肾上腺土也有出血，在心、脾、肺、肾、怀孕母马的子宫、眼结膜、眼脸、膝关节或谢关节以下的皮下组织以及阴囊和辜丸内，均能发现出血及水肿变化。恢复期病马的性拘害包括广泛性全身性动脉炭和严重的肾小球性肾炎。实验感染后观察到的摄伤可分成3个型，即发展(渐进)型、终末(端)型及慢性活动型。从感染后 4 d~6 d观察发展(渐进)型损伤，发现胸腹水过多，淋巴结充而肝大，腾到盲肠脉管水肿，大肠精膜下琳巴绪肿太，还电见粘膜上皮温和坏死。然米（端）型损伤被认为是发展（渐进）型损伤的延伸，表现为皮下水肿，脚腔人基积液，全身所有淋巴结肿胀到不同程度的出，盲肠和结眙有死。粘膜下严重水肿和出血，有时可见肾上腺皮质出血。病毒接种TTTKAONATKACA
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后第12天，可见慢性损伤，包括温利性淋巴结肿胀及胸腔内积液过多。实验感染后观赛到的损伤的严重性很少与自然感染的损伤·-样。2. 4诊断
依据上述流行病学特点，临床症状和病理剖检变化特征等可作出初步诊断，确诊后应该通过实验室病原学和血清学诊断。
3病毒分离
3.1器材和设备
单道微量加择器(0. 5 μL~10 μL,5 μL -10 μL.40 L200 μL,200 μL-1 000 μL)及滴头。一80七冰箱，二氧化碳培养箱。组织研磨器，超声被振药器、低速商心机、倒叠显微镜。3. 2 试剂与材料
血(采自血管）细胞：免肾细胞(RK-13);细胞培养液（见附录A)。3. 3病分离
3.3.1样品的采第
急性病例来最脱纤全血或沉凝白细胞跑层，导分越物、绪魔拭子或流产胎儿的体减及脾脏，被检种节的精液;尸体剖检时采取肺、脾和淋巴结,将病料置于含 1 000 IU/mL 青莓毒素和 1 000 Fg/ml. 链霉素的0. 01 mol/L PH7. 2 磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液>里。这些病料应立即用冰冷却,若不立即接种,应将病料迅速冻存于一80它冰箱。精薇的采集：使用一次射精时精子数量最多的部分获。3.3.2样品的处理
组织样品用含10001L/mL青每素和1000g/mL链霉素的细胞培养液按1：10的比例，置于研磨器中剪辩并研磨。将已研磨好的待检病料，4C1000z/min离心5min，取上清液;分泌物和排泄物样品的处理，将棉拭了充分培动、拧干后奔去试子,410001/min离心5mia，取上清藏；精减冻融3次或超声波裂解处理（100μA.1 min~-2min），用细跑培养液作1 10的稀释，4 1000 r/min离心5min，取上清液。
将处理好的样品上消液用0.22μm滤器过滤除菌，待用。3. 3. 3按种细胞
将样品悬液接种于RK-13细跑,每份样品接种5 瓶,每瓶(生长而积25 cm)接 1 mL,37℃吸荫1 h,再加 5 mL 维持液。将接种细胞置于 37 ℃、5%二氧化碳条件下培养 12 d,每 2 d~3 d 换维持被一次。
3. 3. 4观案与传代
接种后用倒置显微镜逐日观察细胞是否出现细胞病变（CPE)，出现者收获，无CPE者再盲传3代：仍无细胞病变者弃之。
3.3.5病毒增殖、分装与保
RK-13细胞上出现CPE的病毒惑液用1mL无菌小管分装，作为原始毒置于一80C冰箱或减氮罐2
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中保存。
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将原始毒接种RK-13细跑，37℃5%二氧化碳条件下培养并差日观察细胞病变，70%以上细胞出现病变时收集细胞病毒液,按1 mL每小管进行无菌分装,置一80 ℃冰箱保存备用。病毒鉴定按本标准琼脂糖凝胶免疫扩散试验（AGID）和反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法进行。
4琼脂糖凝胶免疫扩散试验（AGID）4.1材料和器械
4. 1. 1器械:直径 6 cm 平血、外径 4 mm 打孔器、加样器。4.1.2阳性血清,标准马病毒性动脉炎高免血清。4.1.3阴性血清：无马病毒性动脉炎抗体和细胞毒性的键马血清。4.1.4标准抗原：纯化浓缩的马病毒性动脉炎病毒。4.1.5待检抗原：抗原应无污染，取少蚤样品加最少量的无菌生理盐水磨碎房作为待检抗原病毒分离物浓缩（用聚乙二醇8000做100倍浓缩）后亦可作为待检抗原。4,2试验方法
4,2.1琼胎平血的制作(所用试剂均为常规分析纯试剂）：见附录B。4.2.2打孔;用直径4mm金属打孔器在已凝固的琼脂糖凝胶平血上打孔，扎距为3m+打孔后用针挑出初下的孔内琼胎块。wwW.bzxz.Net
4.2.3加样：用微量加样器或毛细吸管，吸取抗原或血清加于孔内，中央孔滴加标准陷性血清，周围的第1孔、第3孔、第6孔满加对照阳性抗原，第4孔滴加朗性抗原，第2孔，第6孔滴加样品（待检抗原），加样量以加满不溢出为度。加伴后静置10min，放人显盒内37进行反应。24h后观察并记录结果。4.3结果判定
结果判定时将琼脂平皿置暗背景或侧强光照射下观察，若对照阳性抗原与标准阳性血清孔之间出现一条清晰、明显的白色沉淀线，而对照阴性抗原与标准阳性血清礼之间无沉淀线则认为试验可以成立，如果沉淀线没有或不明显则本试验不能成立，应该重做。结果判定标准如下：a）阳性：待检抗原孔与阳性血清孔之间出现明显清晰白色沉淀线，并与标准阳性孔的沉淀线相融合。
阴性：待检抗原孔与阳性血清孔之间无沉淀线，标准阳性孔抗原的沉淀线直伸被检样品的孔进,判为阴性。
4.4限制性说明
本方法仅用于马病毒性动脉炭(EVA)病原的普查,可能会出现非特异性反应。建议对AGID阳性样品进行进一步的病原或者核酸诊断。5反转录聚含酶链式反应(RT-PCR)5.1露和设备
PCR（合酶链式反应）护增仪，台式低温离心机、电泳仪，电泳槽，冰箱，紫外灯、紫外凝胶成像仪，3
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单道微量加样器（0.5~10μ、5μL~10、40μ~200μ200μL~1000μL)及滴头，PCR仪和离心。
5.2试剂与材料
5.2.1材料,细胞病毒液战病料组织、外周血液或鼻分泌物。5.2.2试剂：柱离心式小量病毒RNA&DNA抽提试剂盒，核糖核酸聚合酶链式反应试剂盒（逆转录RNAPCRKit）上样缓冲液（1%SDS.50%甘油和0.05%藻酚蓝），溴化乙锭（EB)储存获（10μg/mL）琼脂糖,DJA分子质量标推，异丙醇等均为常规分析纯试剂，电泳缓冲被(配制方法见附录C)。5. 2. 3引物:在马病毒性动脉病毒 0RF1b 的 9 282 bp~~9 466 bp片段设计引物CI:5-CCTGAGACACTGAGTCGCGT-3
DI:5-CCTGATGCCACATGGAATCA-3
扩增目的片段为181bp。
5. 3操作程序
5.3.1样品的采集和处理
样品的采集和处理参见3.3.1和3.3.2。5.3.2病毒RNA的提取
按照相关病毒RNA提取试剂盒操作即可。5. 3.3RT-PCR 扩增
将下列各成分按要求量加人PCR反应管中：RNaseFreedHzO(24μL)：10×OnieStepRNAPCRBuffer(5 μL);25 mmol/L 的 MgCl, (10 μL); 10 mmol/L 的 dNTP Mixture(5 μI.); RNasc Inhibitor1 μL;AMV Rtase XLl μL+AMV-Optimized Ta 1 μL上游引物 CI(20 μmol/L)1 μL;下游引物 DI(2μmol/L）1μl+模板RNAl μL;同时设定阳性和阴性对照。将加有样品和对照 RNA 的 PCR 反应管放人 PCR 仪中,按下列程序和条件进行扩增; 30 min,94 ℃ 2 min+然后按照<95 15 9,42 15 s,68 ℃ 45s)反应 35 个循环,最后再 68 7 min,反应产物可直接电泳检测，亦可于4℃或一20℃保存待检测。5.4电泳
取PCR扩增产物8μL与2μL6倍上样缓冲液混合，点样于2%琼脂糖凝胶孔中,5V/cm电压进行电泳,30min后，于紫外凝胶成像议或紫外分析仪上观察结果。5.5结果判定
在对照成立的前搓下，即阳性对照出现相应大小扩增带(181bp）阴性对照无此带出现的情况下判定结果。样品若出现和阳性对照分子质量相同的特异性扩增带，即判定为附性，否厕为阴性。6酶联免疫吸附试验(ELISA）
6、1器械和设备
96孔高吸附力酶标板（平底，简称96孔酶标板），单道微盘加样器（0.5～10±L5μL～10μL4
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40μL～200μ，2001000μ）及滴头多道微量加样器5μ50μ50~100μ）及滴头，8道量连续加样器(50μL,100μL,150μI..200μ1)及滴头。稀释试剂用灭菌瓶。4℃、一20℃冰箱，普通恒温培养箱：酶标读板仪、微型振满器及磁力搅拌器。6.2试剂与材料
6.2.1包被液：0.1mol/L碳龄盐缓冲液（pH9.6),4℃保存。6.2.2酶标记羊抗马二抗（抗马IgG棘根过氧化物酶结合物）：4℃C保存。6.2.30PD(邻苯二胺）储存液0.05%吐温-20解酸盐缓冲液（PBST)优质脱脂奶粉：30%过氧化氢2 mol/L硫酸(所用试剂均为常规分析纯试剂,配制疗法见附录D)。6. 3操作程序
6.3.1将包被抗原（--20C冰箱保存）用碳酸盐缓冲液按合适浓度稀释，每孔100μL加人96孔酶标板,置密闭湿盒中,1℃过夜。
6.3.2甩冠干包被，用0.02mo1/LPH7.2的PBST洗各孔，甩净。6.3.3重氨洗3饮。
6.3.4封阻，5%脱脂奶粉的0.02mol/LpH7.2PBST(PBST-SM)，每孔50μL，37℃C振荡温育60 min。
6,3. 5被检血清:将每份被检血清用含 1%脱脂奶粉的 0. 02 mol/L PH7. 2 PBST(PBST-SM)按 1 ± 5稀释,每份样品加-排,每孔 50 μL,分别用阻性血清和键康马血作阳性和性对照,最--排作空白对照。
6. 3. 637掠薄温育 60 min。
加酶标二抗：辣根过氧化物酶标二抗用 PBST-SM按 1：1 000稀释，每孔加 50 μL。6. 3. 7
37℃振落温育60min。
6. 3. 9 用 1 倍 PBST 洗板 3 次,甩干。6.3.10加底物()PD:使用时按每毫升使用液加8μL30%过氧化氢混匀而用,每孔加50μL。6. 3. 11避光反应 15 min,用2 mol/L的硫酸终止反应。6.3.12在酶标读板仅上读取490nm波长的吸光度值（OD=），当阳性（0Dgm0.60）和阴性(()D4m≤0.10)对照成立的前提下，样品孔光吸收值为阴性对照孔两倍或两倍以上时判为阳性，否则判为阴性。
6.4限制性说明
本方法仅用于马病毒性动脉炭(EVA)抗体的普查，可能会出现非特异性反应。建议对阳性样品进行病毒中和试验验证，以排除非特异性的阳性样品。7病密中和试验（国际贸易指定试验）7.1器材和设备
96孔组织培养板（平底，简称96孔板），单道微量加样器（0.5μ1,10μL5~~10、40μ~200200μL~1000μL）及满头多道微量加样器（5L~50μL、50μL~100μL)及滴头。4℃、—80℃冰箱，二氧化碳培养箱
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7.2试剂与材料
7.2.1病毒。
7.2.2阳性血清：标准马病毒性动脉炎高免血清。阴性血清：无马病毒性动脉炭抗体和细胞毒性的键马血清。7.2. 3
细胞：兔肾细胞（RK-13），使用浓度3.0×1g°个/mL7.2.5细胞生长液:MEM十10%牛血清十青霉素,链每素(终浓度为 100 IU 或 100 μz/mL,4 记保存】。
7.2.6细胞维持液：MEM+2%筷牛血清+青霉素、链霉素（终浓度为100IU或100μg/mL,4℃保存)。
7.2. 7待检血清:应无污染,1 ℃保存不超过 30 d,试验前 56 灭活 30 min:7.3试验准备
7,3.1病毒素殖：应用静止培养法，在大瓶RK-13细胞形成单层后，移弃细跑培养·接种马动脉炭病毒于单层细胞+置 37 ℃,5% CO:培养箱中孵育 1 h加新鲜细胞维持液,重置 37、5% CO.培养箱中培养，逐日现察，待CPE达到75%以上时收毒，在一80C和4C间反复冻融3次：无菌离心（20001/min)20 min，敢上清分装于1mL小管，4保存备用。7.3.2毒价滴定：用含10%胎牛血清、10%新鲜豚鼠补体和抗生素（100IU/mL青每衰和1000g/mE链霉素）的稀释液将马动脉炭病毒作10°1至10-稀释，然后接种96孔微量板，每个稀释度接种8孔，每孔25μL,每孔再补加25μL细胞生长液。每孔加入RK-13细胞悬液（使用浓度3.0×105个/mL）50 μL。同时设置 8 孔细胞对照,即用 50 μL 细胞生长液十50 μI. RK-13 细胞悬液。于37℃、5%CO条件下培养细胞观察7d,在细胞对照成立的前提下,记录结果,按细胞半数麵染量方法计算病毒的每25 pL中所含半数组织细胞感染量(TCIDs）。7. 3, 3待检血清、阳性血清和朗性血清经 56 它 30 min 灭活后,自 1 : 2 倍比稀释至 1 1 32。7.3.4病毒工作液的配制:将待检病毒用细胞生长液稀释为每 25 μL含 100个~1000 个TCIDss;作为病毒工作液。
7.4中和试验程序
7. 4. 1 病毒和血清等体积混合后置 37 ℃孵育 1 h或 4 C过夜。7. 4. 2接种 96 孔微量板,每组接种 8 孔,每孔 50 μL病毒和面清混合液,立即补加 50 μL RK-13 细胞悬液（使用浓度3.0×105个/ml.)。7. 4. 3 置于 37 ℃、5% CO2 条件下培养细胞观察 7 d。7.4.4对照步如下所示：
a）病毒对照，取病毒工作液，用细跑生长液作10-1、10-\、10，10-四个稀释度，每个稀释度8 孔，每孔25 μL,加50 μL. 细胞悬液,补生长液 25 μZ达到总量100 μL。b)细胞对照:设 8 孔,每孔加 50 μL 细胞悬液,补生长液 50 μL 达到总量 100 μL。c
阴性对照：设8孔，每孔加人1：2或1110翻释的阴性血清和病毒混合50μL，立即补加50μLRK-13细跑悬液（使用浓度3.0×105个/mL）.置于37C,5%CO：条件下同样培养细胞观察7 d。
7.5结果判定
7.5、1判定条件
7. 5. 1. 1 细胞对脏组应不出现细胞病变(CPE)。6
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7. 5. 1. 2病毒对照,应保证在 1G00个TCIDs的病毒液10-1和 10-\稀释度的各个孔均出现 CPE,10有 1个～3个孔出现CPE,10-“8孔全无CPE。7.5.1.3阴性血清对照应全部出现CPE。7. 5. 2判定标准
在以上对照成立的情况下,哪组阳性血清抗体滴度大于等于 114,即期为阳性。B说明
在以上的检测方法中，当检测结果不一致时，病毒中和试验为最终的判定方法7
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A.1MEM营养液的配制
MEM干粉
去离子水
附录A
（规范性附录）
细胞培养液的制备
1000 mL
充分溶解后经0.22n孔径微孔滤膜滤过陈菌。细跑培养牛长藏是在滤过除菌营菲箍的基础上，按10器加人灭活特牛血清和100I0/mL肯鞋落和链霉素,然后用 7. 5% NaHCO,落液调整 pH 至 7. 2左。细胞培养维持滋是在滤过除菌营养的基础上，按2必如人灭活续牛班清和1000IU/mL青霉素和链霉素，然后用 7.5% NaHCO，溶液调整 pH至7. 2左右。A.2胰酶消化灌配制
Na HPO. -12H.0
Na EDTA
Trypsin
用去离子水定容至1000 mL,静置 4h,用 0.22m孔径微孔滤膜过除菌。分装一20 ℃保存，8
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琼脂糖
生理盐水
(规范性附录)
琼脂乎板制备
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调整 pH7. 4~7. 6.高压消毒 20 min,融化的琼脂待冷至 45 C~50 ℃时,以无菌状态倒人直径 6 cm平血中,每平Ⅲ约7 mL,厚度约为4 mm,待避固后置4 ℃C保存备用，9
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50XTAE电缓冲液
NazEDTA·2H,O
去离子水
50XTAE
去离子水
琼脂糖凝胶
琼脂糖粉术
1XTAE电泳缓冲液
（规范性附录）
PCR试验用试剂溶液
1 000 mL
1000 mL
微波炉中溶解后,冷却至60C左右,加人EB些液使其最终浓度为0.5μg/mL,并充分混匀。10
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