【国家标准】 小反刍兽疫诊断技术

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T27982—2011
小反色兽疫诊断技术
Diagnostic techniques for peste des petits ruminants2011-12-30 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准花管理委员会
2012-06-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标雅由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。GB/T27982—2011
本标准起草单位：农业部热带亚热带动物病学重点实验室、中国动物卫生与流行病学中心，中国检验检疫科学研究院。免费标准下载网bzxz
本标雄主要起草人：包静月、吴晚东、王志亮、李林，刘春菊、王清华、赵文姬、邹艳丽、郑东霞、徐天刚、季金明,姚季四、张乐、林样梅、吴绍强、韩雪清。TTTKANYKACA
1范围
小反兽疫诊断技术
本标准规定了小反兽疫的临床诊断和实验室诊断的技术要求。本标准适用于小反氢兽疫的诊断。2规范性引用文件
GB/T27982--2011
下刻文件对于本文件的应用是必不可少的，凡基注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本女件。凡是不注且期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489-2008实验室生物安全通用要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3. 1
real time quantitative reverse transcription polimerase chain re-荧光定量反转录-露合薛鞋式反应actton
荧光定量RT-PCR反应
在RT-PCR反应体系市加入荧光基断，利用荧光信号积实时蓝测挚个RT-PCR进程，最后通冠标曲线对未知模板进行定量外析的方法。3.2
荧光域值threshold
荧光定量RT-PCR反应的前15个循环的荧光信号作为光本底信号，荧光域值的缺省设置足3个15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。3.3
Ct值Ct value
每个反应管内的荧光信号到达设定的荧光域值时所经厉的循环数。4生物安全措施
进行小反鱼兽疫实验室检测时，如病毒分离、血清处理等，按搬GB194B9—200B。5临床诊断
5. 1 临床症状
5. 1. 1穿然发热,第 2天～第3天体温达40 ～~42高峰。发热持续3 d左右病羊死亡多集中在发热后期。
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GB/T 27982—2011
5. 1. 2眼,鼻大查排出分泌物,最初水样的眼、鼻分泌物日益增多,变成脏性然店结干,动物发出恶臭。由于鼻孔被凸起的结干的鳞屑覆盖，动物打喷嚏和咳嗽。呼吸急促呼吸困难，排痰性咳嗽和眼睛的卡他性分泌物。
5.1.3口腔粘膜充血，口腔上皮和彝腔粘膜出现大量部分粘连的极微小的略灰色坏死点，坏死组织脱落后形成界线分明的糜烂斑。上皮被摄偏好部位为嘴唇，齿龈，牙板，舌头以及母羊荫广的阴唇表面。口腔破损可能伴有大量流凝，
5.1.4发热2d～3d后病畜开始腹泻，伴随严重脱水、消瘦、虚脱。怀孕母羊可发生流产。5. 1. 5 特意性病例在发热开始的 1 d~6 d 内死亡。 亚临床型病例症状较轻,病紊在病 10 d~14 d以后康复
5.2病理变化
5.2.1嘴唇充血，口腔破损程度不等，较轻的只有一处溃疡，严重的出现广泛的溃疡性及坏死性口腔炎涉及牙板、硬聘、颊粘膜和乳突和舌头喙部背面。粘膜病变可延伸至咽挪，偶尔在网骨和摘胃交界处。
5. 2. 2 上呼吸道粘膜可能严重充血,伴有睾孔和气管的溃病。支气管肺炎,肺尖肺炎。5.2.3皱骨粘膜出现严重的充面和溃烂。偶尔，整个肠道出现弥散性的充血，但是，多数情况仪局限于十二指肠、回肠，盲肠和结肠上部分。常见回育肠瓣膜出直。大肠纵向折垂顶部偶尔出现严重的出血形成斑马释条纹。
5.2.4肠琳巴组织坏死、萎陷。助系膜淋巴组织轻微肿大、水肿，脾可能肿胀。上呼吸道粘膜可能严重充血，伴有鼻孔和气管的溃癌。支气管肺炎，肺尖肺炎。肺部淋巴结肿胀并水肿。5.2.5结膜出现胀性结膜炭。肾和膀既可见充血。母羊可见阴户和阴道糜烂。5.2.6组织学上可见肺部组织出现多核巨细胞以及细胞内嗜酸性包含体。5.3结果判定
止羊或绵羊出现上述筛床症状和病理变化，羊群发病率、病死率较高，传播迅递，可判定为疑似小反当鲁接。
6实验室诊断
6.1样品采集与运辆
6.1.1样品的采集
6.1.1.1每个发病羊群最少选择5只病高采集样。6.1.1.2选摔处于发热期体温40℃~41C）、排出水样眼分泌物，出现口腔微病,无腹泻症状的活畜采集样品。采集结膜棉拭子2个、算粘膜柄拭子2个，颊部粘膜棉拭子1个，分别在300uL灭菌的0.01 tnol/L \H7.4酸盐缓冲被6.1.2.1样品来集后，置冰上冷藏送至实验室检测。6. 1. 2. 2血清储存应置于一20 亡冰箱。2
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6.1.2.3棉子、病料组织和肉制品储存应置于一70℃冰箱。6.2 器械与设备
GB/T 27982—2011
5%二氧化碳培养箱，DNA热循环仪，低温高速离心机，电泳和电泳槽，凝胶成像系统或者紫外检测仪，实时荧光定量PCR仪，96孔高吸附性酶标板，洗瓶或者洗板机，温箱，酶标仪。6.3病毒分离与监定
6. 3. 1 试验材料
非洲绿瘊肾(Vcro)细胞,PH 7. 4 磷酸盐缓冲液(PBS)(见 A,1),细胞培养薇(见 A. 3),细脑培养瓶，
6.3.2样品处理
棉拭子充分拾动、挤干后弃去拭子，加人青霉素至终浓度200IU/rnI.，加人链囊素至终浓度200g/mL。37℃作用1h。3000g离心10min，取上清液300μL作为接种材料。用灭菌的剪刀乃、锻子取大药0.5 g组织样品或肉制品,置于研钵中,剪碎，充分研磨,人5 ml,灭菌的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲被（含青霉素200IU/mL，链毒素200μg/mL），制成1*10悬液。37 ℃作用 1 h。 3 000 g 离心 10 min,取上清 5 mL 作为接种材料。不能立即接种者，应将上清效一70亡保。6.3.3样品接种
取样品上清液接种已长成单层的Veru细胞，37℃恒温箱中吸附2h，加人细胞培养液，置5%二氧化碳培养箱37℃培养。
6.3.4观察结果
接种后 5 d内,细胞应出现细胞病变效应,表现为细胞融合,形成多核休体。如接种 5 d-6 d后不出现细胞病变，应将细抛培养物盲传三代。6.3.5病毒的监定
将出现细胞病变的细胞培养物,按“6,4RT-PCR方法\和\6.5荧光定量 RT-PCR 反应\做进一步鉴定。
6.3.6结果判定
样品出现细胞病变，而耳RT-PCR方法或实时荧光RT-PCR方法鉴定结果阳性，则判为小反鱼兽斑病毒分离阳性+表述为检出小反当兽疫病毒。否则，表述为未检出小反善疫病毒。6.4RT-PCR方法
6.4.1试剂与材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试。实验用水符合GB/T6682的要求。TRIzol 试剂,三氯甲烷,异两醇,无水乙醇,DEPC处理过的水(见术录B),反转录酶/Taq DNA 聚合酶混合滋，2×一步法RT-FCR反应缓冲液，1.5%的琼脂糖凝胶（见附录B).0.5×TBE缦冲液（见关录B)漠化乙链。
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GB/T 27982-2011
可以来用引物NP3/NP4用于小反当兽疫病毒核酸的检測，引物的靶基因、位置、序列和扩增产物的小见表1。
表1用于小反曾疫病毒 RT-PCR检测的引物引物
6.4.2样品处理
正向引物
反拘引物
靶基因
N基因
序列(5°-3')
TCTCGGAAATCGCCTCACACACTG
CCTCCTCCTGGTCCTCCAGAATCT
将棉拭子充分捻动、挤于后弃去拭子，敢100μL样品液至一新的离心管中，人1 mI.TRIzal试剂，振混匀，进行RNA提取。
取大约100mg组织样品，剪碎后，加人1mLTRIzol试剂充分勾浆后转移至1.5mL离心管中，进行RNA提取。
6.4.3RNA提取
经 TRlzol 处理的样品液 12 000 r/min,4 C离心 10 min,取上清,静置 5 min。加 200 μL 三氯甲烷,振药混勺,15 s,静置 2 min~～3 min。12 000 r/min,4 C离心 15 min,取 400 μL 上层水相到新的离心管中,加 400 μL的异丙醇,混勾，静置 10 min。12 000 r/min,4 离心10 min,去上清。加入 75%乙醇1mL，混勾，12000+/min，4离心5min，去上清。再加人75%乙醇1mL，混匀，12000r/min，1℃离心 5 min，去上清。于燥 RNA沉淀后加人 100 μL DEPC处理过的水落解。立即进行 RT-PCR反应或一70℃保存。
6. 4. 4RT-PCR 反应
反应体系为 25 μL,依次如入以下成分:12, 5 μL 2 ×一步法 RT-PCR 反应缓种液,I μL 正向引物NP3(1o μtol/L),1 μL反向引物 NP4(10 μmol/L),1 μL 反转录酶/Tag DNA案合酶混合波,4. 5 μLDEPC处理过的水,5 μL RNA模板。每饮进行RT-PCR反应时均设标准阳性,阴性及空白对照。标准阳性用阳性对照 RNA作为模板，标难阴性用Verv细脑RNA作为模板,空白对照用DEPC处理过的水作为模板。RT-PCR 反应条件为:50 ℃反转录 30 min;94 C,2 min 进行 Taq 酶的激活;94 C，30 s,55 C,30s,72℃，30s,共35次循环；72延伸7min。6. 4. 5PCR 产物的电泳
取 PCR产物 5 μL在 1, 5%琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统中观察结果。6. 4. 6质控标准
小反当兽疫病毒 RT-PCR标准阳性对照有大小为 351 bp 的特异性阳性扩增条带,标准阴性对照和控白对照无任何扩增茶带，说明质控合格。6. 4.7结果判定
样品有大小为351bp的特异性阳性扩增条带判为RT-PCR结果阳性，表述为检出小反当兽疫病毒核酸。
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样品无特异性的阳性扩增条带判为RT-PCR结果阴性，表述为未检出小反兰兽疫病毒。6. 5荧光定量 RT-PCR 反应
6.5.1试验材料
TRIzol 试剂,三氧甲烷,异丙醇,无水乙醇,DEPC处理过的水(见附录 B)、2×一步法荧光 RT-PCR反应缓冲液, Taq DNA 檗合酶,反转录酶,参比荧光 ROX TI 。引物和探针：引物和操针针对小反自兽疫病毒V基因保守序列区段设计，引物和探针的位置和序列见表2，
表 2用于小反台曾疫病毒实时荧光定量 RT-PCR 检测的引物和探针引物
PPRNBa
PPRN9h
PPRN1OP
6. 5. 2RNA 提取
同6.4.3.
正向引物
反向引物
6. 5. 3 荧光定量 RT-PCR 反应位置
1213-1233
13271307
1237-1258
序列(5° - g\)
CACAGCAGAGGAAGCCAAACT
TGTTTTGTGCTGGAGGAAGGA
FAM-5'-CTCGGAAATCGCCTCGCAGGCT-3'-TAMRA反应体系为25L，依次加人以下成分：12.5μL2×1stepbuffer，1μL正向引物PPRN8a(10 μmol/L),1 μL 反向引物 PPRN9b (10 μmal/L),0. 5 μL 探针 PPRN10p (10 μmol/L),0. 5 μL TqDNA 聚合酶,0, 5 μL 反转录酶,0. 5 μL 参比荧光 ROX II,3. 5 μL DEPC 处理过的水,5 μL RNA 模板，每次进行荧光定量 RT-PCR时均设标推阳性、阴性及空白对照。标准阳性用阳性对照 RNA作为模板，标准阴性用Vero细胞RNA作为模板，空白对照用DEPC处理过的水作为模板。荧光定量RT-PCR反应条件为：42℃反转录30min;95℃，10min进行Tag酶的激活；95，15 s,60 ，1 min,共 50 次循环;每个循环在 60 C，1 min时收集荧光信号。6.5.4质控标准
读取每个样品的Ct值，
标准阳性对照样品有待异性扩增曲线而且Ct值≤30，标阴性对照和空白对照无特异性扩增曲线，说明质控合格。
6. 5. 5 结果判定
样品有特异性扩增曲线而且Ct值≤4O判为实时荧光RT-PCR扩增阳性，表述为检出小反曾疫病毒核酸，
样品Ct值>40或者无特异性扩增曲线判为实时荧光RT-PCR扩增阴性，表述为未检出小反当兽疫病毒核酸。
6. 6 竞争 ELISA 方法
6.6. 1试验材料
包被用抗原:PPRV疫苗株重组N蛋白。对照血清，强阳性血清,弱阳性血清、翻性血清。单克隧5
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抗体：小反负兽疫病N蛋白的单克隆抗体。酶结合物：辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠血清。封阅缓冲液，洗涤缓冲，魔物溶液及终止液，配制方法见附录。6.6.2抗原包被
PPRV重组N蛋白用包被缓冲液1+3500倍稀释后，每孔50μL包被96孔酶标板，37置盒吸附1h，用洗涤缓冲液洗板4次。6.6.3血清加样步源
每我加人45L封闭缓冲液。每份持检血清做2孔，每孔加人5μL待检血清。设强阳性血清对照孔(C++)4 个,每孔加人 5 μL强阳性血清,设阳性血清对照孔(C+)4 个,每孔加入 5 μL 弱阳性血清，设阴性血清对照孔（C一）2个，每孔加入5uL阴性血清，设单抗对照托（Cm）4个，毒孔加入5L封闭缓冲液，设酶结合物对照孔(Cc)2个，每孔加人55 μL封闭缓冲液。6.6.4单克隆抗体的加入
除酶结合物对照孔外,每孔加人 50 μL工作液度的单抗,37℃置湿盒作用 1 h,用洗涤绶冲液洗板4。
6.6.5随结合物的加入
每孔加入50μL工作浓度的酶结合物，37置湿盒作用1h，洗涤缓冲液洗板4饮。6.6.6显色与终止
每孔加入50μL底物溶液，37℃避光反应10min，每孔加人50μL终止液。6.6.7读值
酶标仪预热15min.读取每孔492Ⅱm波长的吸光度值（OD值）。6.6.8计算抑制率
按照式(1)计算每孔(包括对照孔)的抑制率，并计算每份样品的平均抑制率。P1=100-0Dr 0Dc) × 100
式中：
PI抑制率；
ODt——试验孔或对照孔 OD值;
ODc—单抗对照孔 OD 平均值。
质控标准
结果在质控标准（见表3)范围内，则试验成立。表3小反鲁疫竞争ELISA检测方法质控标准项目
Cm 孔的 OD 值
Cc 孔抑制率
Cm孔抑制率
最大值
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最小值
乙十十孔抑制率
C+ 孔抑制率
C—孔抑制率
6, 6. 10 结果判定
表3（续）
最大俱
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最小值
平均抑制率(PI)≥>80,判为强用性,50<平均抑制率(PI)≤80,判为弱阳性,表述为小反鲁疫血清学阳性。平均抑制率(PI)≤50,判为阴性,表为小反负兽疫抗体血清学性。7综合判定
凡具有 6. 3. 6,6. 4. 7,6. 5. 5,6. 6. 10 中在任何一项阳性者,均判为小反当首疫阳性。了
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A. 1PH7,4 磷酸盐缓冲液(PBS)
NaHPO,-2H,
附录A
（规范性附录）
病毒分离鉴定溶液的配制
用HCI调节溶液的pH值至7.4,加去离子水至 1000mL,在 1.034×105Pa高压下蒸汽灭菌20 min。保存于室温，PBS 经使用,于 4 保存不超过 3 周。高糖型DMEM培养液
高糖型DMEM
碳酸氢钠(NaHCO,）
超纯水
1000 mL
充分溶解后,0.22 μm 微孔滤膜过虑除菌。4 亡保存。A.3细胞培养液
高糖型DMEM培养液
胎牛血清
加入青霉素至终浓度200 IU/mL,链索至终浓度 200μg/mL,两性霉素 B至终浓度 2.5 μg/mL充分混匀。4℃保存。
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B.1DEPC处理过的水
去离子水
附录B
(规范性附录）
反转录-合酶链反应溶液的配制
充分混匀，将瓶盖拧松后置于37℃放置过夜，高压灭菌。E.2
5×TBE缓冲液
Tris碱
0.5 mo1/L EDTA
加去离子水调整体积至1000mL。B, 30. 6 × TBE 缓冲液
取100mL5×TBE缓冲液，加去离子永调整体积至1000㎡LB.41.5%的琼脂糖凝胶
琼脂糖
0.5XTBE缓冲液
漠化乙锭溶液（10mg/mL）
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称取075琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加人50mL0.5×TBE缓冲液，加热溶解，冷却至50它～60℃时人2.5工漠化乙锭落液，倒人胶槽内自然凝周。GB/T27982—2011
包糖摄种落
去离子水
附录C
（规范性谢录）
竞争确联免吸附试验溶液的配制-0.05mol/pH96磁酸盐/重磁酸盐载冲滴0.318g
用0.22F血膜过滤除菌，室温保存备用，C.2洗涤缓冲液
吐温-20
PH7.4 PBS
pH7. 4PEST (0.05%吐温-20)
1000mL
C. 3封闭缓冲液(含 3%BSA 的 pH7. 4 PBS)BSA
封闭液要临用前配制。
C. 4 鹿轴溶症
C. 4, 1A液
Na,HPO
柠橼酸
过氧化氢尿素
去离子水
临用前配制,避光 4 ℃-8 ℃保存。C. 4.2B液
柠橼酸
TMB(3,3\-二氨基联苯胺）
去离子水
1 000 mL
100 mL
100 mL
用0.45μm滤膜过滤，临用前配制，避光4℃保存。C. 4.3用法
使用时,将 A 液,B液按 1 1 的比例混合。10
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