【行业标准】 饲料添加剂 产朊假丝酵母

ICS 65.120
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1969—2010
饲料添加剂
产假丝酵母
Feed additive--Candida utilis2010-12-23发布
2011-02-01实施
中华人民共和国农业部
本标准遵照GB/T1.12009给出的规则起革。本标准出中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标雅由全国制料T业标准化技术委员会（SAC/TC7S)归口.本标推起卓单位：中国农业科学院何料研究所。本标准起草人：王建华、杨雅麟、漆达、工秀敏、田子罡NY/T 19692010
1范围
饲料添加剂产假丝酵母
NY/T19692010
不标准规定了饲料添如剂产航假丝酵母的定义，要求、试验方法、检验规则以及标志、包装、运输和贮存。
本标准适用了词料添加剂产假丝醇酵母：规范性引用文件
下列义件对于本文件的应用是必不可少的，儿是注口期的引而文件，仅新口期的版本适用下本文件：凡是不注口期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T191包装储运图示标志
GB/T4789.282003食品卫生微生物学检验染色法培养基和试剂GB/T64.35饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定GB/T8381.2饲料志贺氏菌的检测方法GB10648饲料标签
GB/T13079饲料中总神的测定
）铜料中铅的测定原子暇收光谱法GB/T 13080
GB/T 13081
何料中汞的测定
GB/T13082
简料中锅的测定
GB/T 1309)
G13/T 13092
铜料中沙门氏菌的检泻方法
词料中霉菌总数的测定
GB/T 13093
伤料中细菌总数的测定
GB/T 14699. 1
GR/T 17485
GB/T 23743
饲料来样
饲料中黄曲毒索的测定酶联免疫吸附法铜料中凝固酶阳丝葡谢球菌的微生物学检验Baird-Paurkt琼脂培养基计数法国家质量监督检验检变总局令2005]第75号《定量包装商品计量监督管理办法》3定义
下列定义适用于本义件。
饲料添加剂产假丝酵母TeedaddiliveCandidais以淀粉、糖密等碳水化合物和铵盐，豆，棉粘等含氮物质为培养基主要成分，在固态或态发障工艺等控制条件下，接种培养产假丝酵母，获得的纯培养物添加适昼的载体（膨化的皮、卡米芯、类等）即为饲料添加剂产航假丝酵母，4要求
4.1微生物学指标
4. 1.1菌体形态
细胞旱椭圆形，大小为3.5mm~7.5mm7.0um13.0m,以多边出芽方式进行元性繁殖，形成假菌丝。无有性孢子，不产生色素，NY/T 1969—2010
培葬形态
表芽汁琼脂增养基：菌落乳白色，半滑，有或无光洋，边整齐域菌丝状，h
抑盖片的卡米粉凉脂培养基：菌落形成假菌丝。葡萄糖强白陈一酵母提取物培养基;表面无菌膜，液体浑浊，管底台菌沉淀4.1.3生理生化特征
饲料添加剂产阮假丝醉母的生理牛化特征见衣1。表1
饲料添加剂产假丝酵母的生理生化特征特征
衡萄糖
棉子糖
麦牙糖
D-葡萄糖
T）半乳黏
L.-梨榨
D本糖
1.-阿拉伯糖
L-最李糖
麦芽糖
虾维二钳
密一罐
棉子辖
无维牛素培养基牛长状况
熊果裂祥更验
类淀粉化合物的形成
抗0.91岁放线菌酮实验
案分解实将
海巢糖
松三辨
可落性淀粉
赤苎糖辟
T）H露醇
半乳糖醇
山梁醇
巯斑酸
柠檬醛
LL-乳酸
水杨苔
退度实验
高透压
牛长实验
50葡带糖
10%氨化钢
15%葡萄精
1%乙峻培养基中生长实验
LBB实验
注：\十”为阳性反府；“一“为阴性反应“为可为阳性反应亦可为国性反应。4.1.4分子生物学特征
产假丝母经18rD)NA5'端通用引物ITS1和ITS2区内端特征引物CU(P2)进行PCR扩增后出现449bp的特征计段.经18SrDNA5端通用引物ITS.（P1)和28SrDNA3端通用引物(P3)进行PCR扩增后出现565bp的特征片段，有别于其他真菌4.2感要求
应符合表2的要求。
表2饲料添加剂产玩假丝酵母的感官要求项后
4.3水分
其有辞母特获气味，尤激，尤导臭殊无异物
均创粉未状、题粒状或条
不高于9.0%
4.4产假丝酵母活菌数
产假丝浮母活菌数1X10°CFL/g(DW)4.5卫生指标
应符合表3的规定，
表3饲料添加剂产航假丝酵母的卫生指标项目
黄曲素 [4/kg
总础(以 A:计)+ng/ kg
以Ph，ng/g
k，ng/lkg
锅,mg;kg
细荫总数，CFU/
零荫总嫩,CFU/g
沙门氏菌
恐贺氏菌
凝凋酶阳件萄萄球，CIU
5试验方法
除非另有说明，在分析中使用分析纯的试剂和蒸馈水或去离了水。5.1采样方法
接GB/T14699.1执行，采样时无菌操作。5.2感富检验
不得检
不得险出
取100g样品置于十疗白色纸片上，观察其色泽、形态、有无杂质，嘎其气味。5.3产脆假丝酵母鉴别
5.3.1形态鉴别
5.3.1.1培养基
NY/T1969—2010
芽汀琼脂培养基：10\波美度麦芽汁11.20.0g琼脂，115℃灭菌15mim。a
b）干米粉琼脂培养基：将42.0g玉米粉加入1L去离子水60℃加热1h，用滤纸过滤再加水至1L，期人12.0g琼脂济解，121C湿热灭菌15mit.葡菊糖蛋片陈一酵书提取物培养基：将20.0g葡萄糖、10.0g蛋白陈剂5.0%酵母捉取物溶丁11.么离子水中。121℃灭菌15min。5.3.1.2在麦芽汁琼脂培养基上的培养形态28培养3d后，其形态特征符合4.1.2中a)的描述，5.3.1.3在加盖片的玉米粉琼脂培养蒸上的生长特性衣玉粉胎平板的一边相当下表盘10点至2点的位置划单线接种，在平板站边相当于衣盘4点和8点的位臂处按种两个点。然后，在单线接种的叶间盖工一片尤菌盖玻片，在点接种的一个点盖上片无菌盖玻片，了28℃下赔养3d~7d后直接在显微镜下观察，其形态特征符合4.1.2tb)的描述。5.3.1.4在葡萄糖一蛋白陈一酵母提取物培养基中的生长特性28C静置增养3d后，让形态特征符合的、1.2中的猫达，敢少母菌体丁显微镜下观察.其形态特征符合4.1.1的捐述，
5.3.2生理生化特性
NY/T 1969—2010
按附录八的方法执行
5.3.3分子生物学特征
按谢录B的方法执行。
5.4产玩假丝酵母活菌数一平板菌落计数5.4.1培养基
孟加拉红培养其接GB4789.28—2003中4.80的规定。5.4.2操作步
e）以无菌操作称取检样25.0g，放人含有225ml.灭菌尘盐水的玻塞一们瓶中，振播30min,即为1：10稀释液。
用灭菌吸管吸取1：10稀释液19111.江人灭菌试管，另用1mL灭菌吸管反复吹吸5次，使b)
细咆充分散开。
取1mL1：10稀释液注人含有9ml火菌生班盐水的试管.5换一支1m灭菌吸管吹吸5c
次，此液为1：100稀释液。按十述操作顺序做10倍递增释液每释释一次，换用支「mL灭菌骏管。
）将灾菌的孟加拉红培养基熔化后倒入无菊平板中，待其凝固后，根据对样品菌数情况的估川选择三个合适的稀释度.用无菌吸管吸取0.2m稀释液于在孟加拉红琼脂平板中，用无菌刮铲或玻璃涂棒将菌液在半板上涂布均匀，每个豁释度做2个平亚.室温下静置20min~30min，使菌液浸入培养基.例置」28℃温箱中，3d后开始观察，其观察5d。计数方法1：通常选择菌落数在10-~150之间的平血逊行讨数，同一祷释度的2个平而的菌落e
平均数乘以5，可乘以稀释倍数，所得数字即为每克检样中所含产假丝酵册活菌数f计数力法2：刘有特别要求或有异议的少数样品可借助FCR技术精确定量，即从上一步e)的每个播释度平板上随机挑取IO个菊落作为IDNA模板，按附录B的方法进行产脱假丝醇母PCR定性检测，产假丝醇母PCR阳性菌落数否ICR定性检测总菌落数的比例即为目标菌比例系数。每克检样中所含活菌数（即计数方法1所得活函数）乘以日标菌比例系数即为每检样中所含产既假丝酵母活菌数：
8）报告：每克样品所含产脆假丝酵母活菌数以（FIUJ/g(I)W)表示。5.5水分测定
按B/T6435的规定行。
5.6卫生指标测定
5.6.1黄曲零素 1,测定
按 GB/ T 17480 执荐。
5.6.2总砷含量测定
按(GB/T13079执行。
5.6.3铅含量测定
按 GB/T 13080 执行。
5.6.4汞含量测定
按GB/T13081执行
5.6.5镉含量测定
按 GB/T 13082执荐。
5.6.6细菌总数检测
投（B/T13003执行。
5.6.7零菌总数检测
按GB/T13092执行
5.6.8沙门氏菌检测
接 GB/ T 13091 执行。
5.6. 9志贺氏菌检测
按（B/T 8381.2执行。
5.6.10凝固酶阳性葡萄球菌检测接（B/T23743执行，
6检验规则
6.1出厂检验
NY/T 1969—2010
同一批投料、同一条生产线、向一班次的产品为-批：产品出厂前应经生产单位检验部门逐批检验个格，准签发产品质量检验合格证。6.1.2出厂检验项目
感官要求、产玩假丝摩母活菌数、水分、细菌总数和霉菌总数、6.2型式检验
般情况下，生产企业半年进行次型式检验，有下列倩况之一时，也应进行型式检验：更改丰要原辅料和配料时；
h）觅改关键工艺时：
停产后恢复牛产时：
d）国家质量监督机构提川迹行型式检验要求时。7判定规则下载标准就来标准下载网
7.1在保证产品质量的前提下，生产可根据工艺、配方、设备、原料等变化清况，白行确定出厂检验的批量
7.2以本标准的有关检测方法和要求为依据进行判定：检验结果中有一项不符合本标准求时，括是微牛物指标（细菌总数、霉菌总数、沙门氏菌、志贺菊和凝固酶阳葡衡球菌指标），判定该批产品为不合格品，不得复检，若足其他项，应重新从该批产品中加倍抽样复验，复验结果仍有项不合格，判定该批产品为不合格品：
8标志、包装、运输、贮存和保质期8.1标志
8.1.1销售产品的标签应符合GB10648的规定8.1.2储运图示的标志应符合GB/191的有关规定。8.2包装
8.2.1包装材料应符合国家有关的安全，卫生规定。8.2.2净含量应符合国家质量监督检验检疫总局令第75号的规定。8.2.3包装应密片、无破损。
8.3运输
运输过程中要防止雨、盐、日晒、高温、受潮、重长和人为损坏。8.4贮存
NY/T 1969--2010
产品应贮存于阴凉、十燥处，不得与有索、有害及有异臭味物质-起贮行8.5保质期
不概于180d。
A.1糖发酵实验
附录A
【规范性附】
产脱假丝酵母生理生化实验方法NY/T1969-2010
产脱假丝酵母菌种刘糖的发醉实验采月杜氏管(Durhamtube)法。糖发酵底物包括：葡萄糖（glucose）、半乳糖（galactus）、熊糖（s1c:Tose）、麦芽糖（maltose）、乳糖（lactose).棉子糖（raffinosr)和海糖（trehalusc），所用化合物均为分析纯。将棉子糖用蒸馏水配戒10为(/母液，其他糖用蒸馏水配戒20%（/)母液，过滤除菌后置4℃下备用。蒸缩水配制0.5%（w/v)酵母提取物（YeastFxtract)溶液.取3.6ml.分装于口径12mm试管中，放人例置的发酵管，用棉室1后115℃灭菌30min冷却后每个试管内无菌加人0.ml.糖母液备用
将产假丝酵母划线接种于友芽汁琼脂培养.基上.25℃培养26-~3d进行活化，再转接丁麦芽汁培养居中，于25℃C培养2h-48b，制成细跑慧浮液。以每试管0.1mL的量接种丁准备好的发酵试管内：摇勾.25%下培养网周，期间规察杜氏管内是否有气体积存及其积行量，第一周内每天记录次，第二周内每2α-3d记录次，最后结果以下述符号表示：十强发酵，7d内气休迅速充满倒置管：延迟发，7d后倒罩管才迅速充满气体：弱发酵，倒置管内有气体，但直最后也未充满，w
不发醛，倒置管内无气体积存
V同种内有的菌棵发醇，有的不发酵或弱发酵，麦芽汁培养基：将友案提取物稀释率10°波关度，115℃灭菊15min。A.2碳源同化实验
选用以下26种碳源化个物作为同化试验对象：六碳糖：D·葡萄耕（）glucose）、D-乳糖(I）galectose)I，梨糖（L-sorbasc)：五磁糖：T)-太糖（L)-xylose）I.-阿拉伯糖（L-arahino>sc）、L-鼠李铺（I.-rhatnuose）：双糖：薰糖（sucrose）、麦芽糖（raltase），纤维二糖（celiobiose）、海藻糖（trehatase）乳糖（lactose）、蜜二糖(nelibiose)；
三糖：棉子糖（raffinose）.松三糖（melezitosc)）：多糖：可溶性淀粉（solublestarch）：醇类：赤薛糖婷（erythritol）、D）甘露醇（T）-manrnitol）肌醇（inositoi）、甘油（glyceml），半乳糖醇(galactitol)，D-山梨醇(Dglicitolrsorbitol)乙醇(ethanol)；有机酸：琥珀酸(succinicacid）、柠檬酸（citricaid)、DL-乳酸（DI，lacticucit)：糖苷：水杨（salicin）。
所用化合物均为分析纯！
首先，把各种碳源分别配成10倍葡糖浓度的同化母液，具体方法为：称取6.7臀母含氮基础培养基（YeastNittogenBase），加入与5.0g葡葡糖相当的碳源化个物（邮与5.0名葡糖含有等摩尔的碳），棉子糖浓度加倍.溶于100mL去离了水中，若是有机酸先把酸度调至pII5.7.过滤除菌后放入f
NY/T1969—2010
4℃泳箱作为同化母液备用、
第二步.在12mtn口径试管中每管加入3.6mL蒸馅水，121灭荫30min后加人0.4mL同化母液制成同化管备川。
最后，把培养了24h~48h的产脱假丝醇母菌体用无菌水或氮源基础液体培养基制成细胞悬浮液！调整细胞浓度使悬液至半透光（A510=1.0），然后用无菌吸管将悬浮液滴人准备好的同化管内，或用移器吸入40u~-50uL，25℃下静置培养1、2周和4周，分别记录结果。同化结果的观察与记录方法：取片色卡片，共上用墨汁或黑色墨水划上约3/4mm宽的直线，把培养一段时问后的同化管充分摇勺，站于该卡片上，透过培养液观察卡片上的黑线，并根据下原则记录：
十十一透过试管完全污不见黑线：1「可见黑线但呈发散的模糊线条；十黑线川见但边缘模糊；
黑线消断可现月边缘不模糊：
同化结果按以下记录：
强同化，两周内为「或十二一；「延滞同化，两周后巡这变为一十或！」缓慢同化，两周后缓慢变为「十或十一十：S
弱同化，记录为十：
不同化：
（十）少数情况可以同化：
V有些菌株同化反应为：，有些菌株同化反应为一；十/W可以同化或弱同化，所有菌株都可以生长，有些生长较期；弱同化戴不同化：
4.3在无维生素培养基上的生长状况在12mmLI径试管中加人4.0ml.维生案培养基，121℃灭菌15min：接种方法：挑取-环培养了241--48h的产胱假丝酵母菌体，接种于一管维生素液休培养基中，25℃震荡培养2c3d,将卵跑内所携带的外源维牛素消耗下净，再接满（约0.2L)此菌悬液于第二支无维生素培养基中，25℃培养3d7d后记录，记录方法与A.2相同！无维牛素培养其取5.0g硫酸铵、10.0g葡糖、10mg组氨酸盐梭益、20mg甲硫氨酸、20mg色氨酸、500mg溉酸、40mg硫酸铜、100tng碘化钾、200mg氯化策、400m1g硫酸锰、200mg钼酸钠、400mg硫酸锌、850trg磷酸：氢钾、150mg磷酸氢二钾、500mg硫酸镁，100tng氯化钠和100mg氯化钙,离了水补足至1L。
A.4熊果苷裂解实验
熊果首源脂培养基配制：熊果0.%，酵母粉0.5.琼脂2%，121'℃灭菊301ri。火菌后即加人无离1%柠檬酸铁铵，倒平板备用。把培养了24h~48h的产狼丝酵母菊休划线接人熊果节凉脂平板上，25℃培养，若2d~5d内培养基中有深褐色色索山现，则结果为阳性。4.5类淀粉化台物的形成
选取A.2中培养四周后在含糖类或多儿醇炎化个物的同化管中呈阳性反应的试管，每管滴人1滴2滴路哥（LgaI)低碘激，择匀，显蓝色，紫色或绿色者为阳性，表明有类淀粉炎物质产，否则为8
阴性，
Lugol碘被的制备：把1.0g碘、2.0g碘化钾游于300mL蒸馏水i备。A.6抗放线菌酮实验
NY/T 1969—2010
10倍放线菌酮呼液的制备：1001mg放线菌酮溶解了2.5ml.内酮中，将此辫液加人到含6.7g醇母氮基础培养基和10.0g葡萄耕的溶液中，蒸馏水定容至100m山，充分混合后过滤除菌，备用。在12mm1轻试管每管加人3.6ml，蒸馏水，121℃灭菌30mi，加人0.4ml.放线菌用母液，使其最终浓度为0.01%，接种方法，培养条件及结果记录与A.2相同，在择床上振荡培养。A.7尿素分解实验
把培养了24h~48h的脱假丝醇母菌体接种于Christesen尿素凉脂上，25培养5d，其间每天观察次，出现深粉红色省为阳性反应。Christe.nsc11水素琼脂的制条：玻1.0g蛋凹陈、1.0g葡萄糖、5.\g氧化钠、2.0g磷酸二氧钾和12m1g酚红，溶于1L蒸馏水中，调pH为6.8.加人20.0g琼脂，加热熔化后分装试管，每只试管中分装1.5，110%次菌30min后，每只试管加入0.5ml.过滤除菌的20%尿素，混匀，做成斜面备用A.8DBB 实验　
把培养24h~48h的产脱假丝酵母菌体接种于碳基础—尿素琼脂上，25培养5d~7d，然后55℃培养过夜，冷却到案温，加人1滴-~2滴新配制的冷的DBB反应液，究温下1min~2min后出现深红色到紫红色者为阳性
碳基础一尿素琼脂培养基的制备：将:1.7g酷丹碳础培养基（Yeast（arbonBase）200mg酸性品红（fuchsinacid）、20.0g琼胎溶于900mL无菌水中，121C灭菌15min，将100mL过滤除菌的20尿素加到溶解的培养苯中，混句.做成斜面或平板备用。J)BB反应液的制备：将15ng固蓝B(FastBlucBSult)溶于15mL冰济过的250mMTris-HCl(pl7.0)缓冲液,放在冰浴中30 min内使川。A.9温度实验
将培养了24h~4$h的*腕假丝酵母菌体接种到YM固体培养需上，分别在37℃和10℃的温度下培养d，观察在各个温度下生长情况·把生长最缓慢的温度定为最高生长温度，YM固体培养基：将3.0g酵舟提取物、3.0麦芽提取物、5.0g蛋白陈.10.0g葡萄糖利20.0g源脂溶解在1L水中，121℃火菌15nin。也可用市售IBactoYMBroth加2%的琼脂代替。A.10高渗透压生长实验
将培养了21h48h的产航假丝悸母菌体接种到含50%（W/V）葡萄糖或含1C%氯化钠和5%菌愉糖的琼脂斜m上，25培养7d~14d，其间每大观察一次。50%葡萄糖坏脂斜而的制备：在500mL1%的酵母浸出粉中先溶解20.0g琼脂，再加人500.0g的葡剂，定容到1L，分装到试管中，110℃灭菌10min，做成斜面备用。斜而变棕色的要舍弃。10%氯化钠利5%菊萄糖琼脂斜的的制各：10.0g醇母浸出粉、100.0氯化钠、30.9&葡葡糖利20.0g璟脂溶解在1.T.水中，分装到试管中，115%℃火菌10min，做成斜前备用：斜面变粽色的案舍弃。A.111%乙酸培养基中生长实验
将培养了21h~8h的产匠假丝掌册谢体点接或划线接种到1%Z酸增养述上，25℃培养3d-6d.观察菌落是街生长。
NY/T1969-2010
1%2酸培养基的配制：将10.0g萄糖、1.0g胰强陈和1.0g酵母粉碎解于700mL蒸留水中，加2.0g琼脂混匀,121%灭菌15min冷却到4iC~50℃时加人1. 0InL冰醋俊,迅速摇匀倒平板
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