【行业标准】 马铃薯品种鉴定

TCS 67.080
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1963--2010
马铃薯品种鉴定
Cultivar identification of potato2010-12-23发布
2011-02-01实施
中华人民共和国农业部
本标准遵照（3/T1.12009给出的规则起草本标准的中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：农业部脱毒乃铃警种质量监督检验测试中心(哈尔滨)。NY/T 1963-2010
本标雅主要起草人：吕典秋、王绍鹏、刘尚武、邱彩玲、箱飞飞、李勇、高云飞、正义重、张、主亚洲李学湛。
1范围
马铃薯品种鉴定
本标雅规定了马伶品种鉴定SSR分子标记方法本标准适用丁马铃品种及种脏资源鉴定。2规范性引用文件
NY/T 1963—2010
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的用文件，仅注月期的版本适用于本文件。凡是不注月期的引用文件，其最新版小(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室川水规格和试验方法G7331马龄薯种薯产地检疫规程
GB18133马铃薯脱毒种薯
3试剂
INA的提取及PCR扩增所使用的实验室独立，微量移液器为分子检测专用：试验中，溴化乙锭染色剂可诱发基因突变·内矫酬胺水辫液具有神经毒性.操作人员在换作过程中需戴于套和口罩。电泳后的凝胶以及被溴化之锭污染的物品要有专用收集处，集中进行无害化处理。以下所川试剂.除特州注明者外均为分折纯试剂.水为符合GB/T6682中规定的一级水。3. 11manl/L三羟基甲基氨基甲烷一盐酸(Tris-HCl)溶液(pH8.0)称取Tris碱121.1g，溶解十800ml.水，用浓盐暖调pIT至8.0.加水定容率：000m，121℃高压火菌20min。
3.20.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pIY8.0）称取乙二铵四乙凌二钠186.1g·溶于70mL.水中，用氢氧化钠调pH垒8.0，水定容率1000mL
3. 3TK缓冲液(pH 8.)
昼取1mol/T.羟基甲基氮H甲烷一盐(Tris-H(I)溶液（3.1)2nL、0.5mol/L乙二饺四乙酸二钠辫液（3.2)0.4ml加水溶解，定容至200ml.121℃高压火菌20min后，室温保存，3.45×Tris-硼酸(TBE)电泳缓冲液称取Trig碱27g、硼酸13.75g.量取0.5mol/L乙--铵四乙酸钠溶液（3.2)1nzL,加火菌双蒸水400)ml.溶解，定容至500mL
3.51XTris-硼酸(TB1c)电泳缓冲液母取5×Tris-硼酸200m，加水定溶至1000rml3.6样品提取缓冲液
称取氮化钠15.2g、1-二烷基磺峻钠(SI>S)0.g、聚乙矫其吡略烷酮(PVP)2、一硫苏糖醇(LX1\T)0.309g+辫:100双蒸水.再加入0.5no1/1.Z二铵四乙酸钠溶澈（3.2)20mL.1mol/，—羟基中薄氨基用烷—盐酸(Tris-HC1)溶液(3.1)20nL、TritronX1001n.-统基乙醇0.8in混合均勾，加水定容至200mL，4%贮存待用。3.7Tris饱和酚十三氯甲烷十异戊醇混合液（现用现配）量取Tris饱和酚25ml、三氮甲烷24mL、异化醇1tmL，混合均匀待用。1
NY/T1963—2010
3.830%丙烯酰胺溶液
称取丙烯微胺29g、N.N-亚甲H双内烯酰胺1名，加水辫解，定穿至100mL.过滤，4℃储存3.910%过硫酸铵溶液（现用现配）称敢0.1过硫酸敏,加水溶解，定容至1 ml.3.1012%聚丙烯酰胺凝胶（双板）量取30%丙烯配胺溶液（3.8)20mL、5×Tris-硼酸（TBE)电泳缓冲液（3.5)10mL、灭菌双蒸水25mL、四甲基乙二胺（TEMFEID)50uL，混勾，制板前加过酸铵裤腋（3.9)500)l混匀灌。3. 11溴化乙锭贮液(10mg/mL)
称溴化乙锭200mg，加水溶解，定容至20ml.。3.12溴化乙锭染色液（0.5μg/ml.)量取溴化之锭液（3.11)101.加水定容至200mL。3.133mol/L乙酸钠溶液（pH5.2)称取乙酸钠·31L.）24.6g，加水80mL溶解，用冰/酸调p[1至5.2.条容至100L3.14100 hpDNA分子量标准物
3.15SSK标记引物序列情况
见附录A。
4仪器
分析天平(量0.0001g)。
4.2台式低温高速离心机（12000r/1nin)：4. 3微量移液器(0. 5 μL-~10 μl,10 μL~100 μL,20 μL--200 μL, 100 μl--1 000 μL) .4.4
冰箱（、20）
稳压稳流电泳仪、水平板电泳、乘直板电泳槽4.66
液氮。
紫外凝胶成像仪：
4.BPCR扩增仪。
紫外分光光度
4.10超净1作台。
5分析步骤
样品的采集和制备
检测材料可以取马铃尝植株的叶片（嫩叶效果好）、休眠的块紧或试管苗。叶片样品采集按照GB1起133和GB7331要求，随机在间深集。片样品用牛皮纸包装，利用冰盒携呼，1条件下保存。块茎租劳样品采集后，利用冰盒薄带，1条件下保存。试管估提取DVA前不开时.防止污染：样品在4℃条件下可保存2用，在--20%条件下叫保存$个月，午70%条件下可期保存：设标样，与样品采用同样方法处理。
5.2 DNA提取
5.2.1称取1马伶薯待检测样品置」研钵中，液氮冷冻下迅速研磨尘粉末状，加入3mL.样品捉取缓冲液(3,6)使其混介均勾,吸取混合液置于1.5 mL离心管中。5.2.2加人等体积的Tris饱和酚1一氯甲烷异戊牌混合液（3.7)，充分混匀，离心3min(12000r/min).级取上清液。此过程壹复一次。2
5.2.3吸上清液(5.2.2)加.人等体积的三氯中烧.120c0r/min离心31min：NY/T 1963—2010
5.2.4吸取上清液（5.2.3）加人1/10休积的3mo1/L艺胶钠（3.13).班人2.5倍体积预冷的无水z障,低温放置 1 h。
5.2.510000t/min离心15min.弃上清：用75%的乙醇清洗沉淀后，10000r/mim离心3min，清洗过程重复「次-2次。
5.2.6弃上清，将沉淀置十通风处于燥至变成白色或透明状态。5.2.7用IE缓冲液（3.5)溶解IDNA，并将溶解液宵于20%冰箱保存。5.31CR（聚合酶链式反应）扩增反应5.3.1PCK反应体系（20μL）
10XPR缓冲液
Mglz(25 mmoi/L)
10 mmol/ L dNTPs
些存浓度的引物（3.15）
TaqINA聚金酶(5 n/)
模板 INA
灭菌双蒸水
先加入灭菌双蒸水，然后按顺序加入上述成分，缓慢颠倒PCR管混匀瞬时离心；对于多个伴品，可先将上述成分(榄板DNA除外)混匀，分装到PCR管中：再加人模板DNA.5.3.2PCR扩增程序
95℃预变性5min91℃变性30s.57℃复性45s，72%延仲90s共35个循不；72℃延伸10min，4%保存．
5.4电泳
5.4.1制备12%聚丙烯酰胺凝胶
胶30%丙烯洗胺溶液（3.8)10ml，加人5×Tris-酸（TBE)电泳缓冲液5ml、无菌水10ml.,再加人10%过硫峻铵溶液（3.9)250uL、四印基乙二胺（TEMEL))30uL，混合均勾，立刻例入玻璃极中，并插入梳了。璃板、梳子的规格均为1.5mm5.4.2加样
电泳槽加人1×Tris硼酸(TBE)电迹缓冲液（3.5),取5L1PCR产物与1uL载样缓冲液混合均匀：加入到点样孔中，另取100bpDNA分子量标准物（Markcr)（3.14)5pI.作为对照，加到相邻的点样孔中。
5.4.3电泳
在190V电压下预泳30min，然后在160V电压下电泳约4.5h。当指示剂一甲举距玻璃板底部1ct时停止电泳。
5.5电泳结果观察
5.5.1聚丙烯酰胺凝胶染色
将电脉后的12%聚内烯酰胺凝胶(5.4.3)浸人到浣化乙锭染色液(3.12)中染色60min，用清水洗去染色液，5min/次，重复一次。5.5.2紫外灯观察
利用紫外观察灯或紫外凝胶成像仪观察PCR反应扩增出的DNA条情，并护照以记求实验结果。6结果判定
6.1结果稳定性判定
NY/T 1963—2010
将一已知马饸薯品种多次扩增，带型稳定后将其作为稳定性参照物，并记录蒂型及条带数量。将待检测码铃薯品种、稳定性参照物、100bpT>NA分量标准物（Markcr)(3.14）一同操作当此品种扩增带型与记录带型一致.H100bpDNA分子量标准物(Marker)(3.14)泳道从上到下依次山现清晰的条带时,实验成立，可以进行结果判定，否则应革新进行实验6.2品种真伪鉴定
将待检测的疑似量种与真实品和1、稳定性测试品种,100 bD>A分子量标准物(Malrker)(3.12)同操作，在快凝胶板上电泳。实验成立时.将疑似品种与真实品种进行百接对比，如果疑似品种与真实品种的条需数贵、带型一缴,贿判定“者为同一品种;反之，为不同品种。附录A
(资料性附录】
用于马铃薯品种鉴定的SSR标记引物NY/T 1963—2010
用于马铃薯品种鉴定的SSR标记正向引物序列、反问引物序列、贮存浓度及终浓度见表A.1。表A.1马铃薯品种鉴定SSR标记引物序列引物
Patalin-F
PalainR
ST0011-F
STMCO14R
序列(5°-+3')
TUT CTT GAC ACG TGT CAC TGA AACTCACCG ATT ACAGTAGC AAG AGA
CAA CCA ACA AGG TAA ATG GTA CCTGO TCT GGT GCA TTA GAA AAAACAG TCT TCAGC CAT AG
TAA ACA ATG GTA GAE AAG ACA AAGAA ACT GCT GCCGGT GC
TGG GGI TCC ATC AAA C
贮存浓度
pmol/Lwww.bzxz.net
经淤度
genoi/L
NY/T 1963—2010
to tup
500 bp
iao bp
附录B
【资料性附录】
马铃薯品种真伪检测结果判定图.
.1,1 50(marlceh
1.稳定性测试品种
2.真实品计
3.凝以1
4.疑以品
注；稳定性徽试品种是克新？号;真窦毕种为大西洋;疑品科工与具实异种杀带数三、节型致，乳定为大两洋品种！疑假品补1与点实品种案带数望、带型推，判是不是大西洋品种。
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