【行业标准】 进出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T0172—2010
代替SV/T01721992
进出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法Determination of Staphylococcus aureusin foods for import and export2010-05-27发布
数码防伪
中华人民共和国
国家质量监督检验俭疫总局
2010-12-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草，言
本标准代替SV0172—1992出口食品中金黄色葡萄球卤茵检验方法》本标准与SN1721992相比，主要技术变化如下：SN/T 0172—2010
将原标准名称出口食品中金黄色葡葡球菌检验方法》修订为进出口食品中金黄色葡菊球菌检验方法》。
将原标准的范围修订为：“本标准适用于进出口食晶中金黄色葡萄球菌检验”在仪器和设备中增加了pH计、大平、均质器并在检样制备中增加了拍击式均质器的拍击速度及时间。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：赵宏，高旗利、雷质文、张海滨、张宏伟、魏亚东、赵良娟、侯厕萍、张曼、李正义、唐静、张健，马维兴。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN0172—1992
合品伙伴网httn
1范围
进出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法本标准规定了进出口食品中金黄色葡葡球菌的检验方法。本标准适用于进出口食品中金黄色葡葡球菌的检验。2规范性引用文件
SN/T0172-2010
下列文件对于木文件的应用是必不可少的。凡是注H期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件，凡足不注日期的引用文件，其最新版木（包括所有的修改单）适用于本文件SV/T1538.1培券基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SV/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南3检验方法
3.1培养基和试剂
3.1.1普通肉汤培养基：见附录A第A.1章，3.1.2胰蛋白豚人豆肉汤：见附录A第A.2章。3.1.3Baird-Perker培养基（BP):见附录A第A.3章。3.1.4中本胺蓝-TDNA琼脂：见附录A第A.4章。3.1.5牛理盐水：见附录A第A.5章。3. 1.6凝固酶试验免血浆:见附录 A第 A. 6章。3.2设备与材料
供常规平板计数用的基本设备与材料。3.2.1
3.2.2L形坂璃棒。
3.2.3 pH计.
3.2.4天平：精确至0.1。
3.2.5均质器或拍击式均质器。
3.2.6无菌均质杯或均质袋（NascoWHIRL-PAK24OZ./710mL.成相当者）。3.3检样制备
3.3.1固体或半固体食品以无菌操作称报25样品，放人装有225ml.灭菌生理盐水的灭菌均质杯（无菌均质袋）内，于8000r/min均质1min2min或用拍打式均质器以每秒6次~9次挤压，拍击1min，制成1:10样品匀液
3.3.2液休食品用火菌吸管吸取25mL样品，放人装有225mT.灭菌牛理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇制成1：10样品匀液3.3.3供计数检验时，可按十进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。htt
SN/T 0172—2010
3.4操作步骤
3.4.1最可能数（MPV）测定法
3.4.1.1适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和含少量金黄色葡萄球菌的食品。3.4.1.2选3个连续稀释度，从每个稀释度分别取1mL稀释样品液，接种3管含10%氯化钠膜蛋白陈人豆肉汤，样品的最高稀释度应达到能获得阴性终点，置36℃土1℃培养18h，3.4.1.3用3mm接种环，从有细菌生长的各管中移取1环，划线接种于表面干燥的3P晾脂平板，置36C+1C培养45h-48h。
3.4.1.4从有细卤牛生长的每一平板上至少挑取5个可凝金黄色带葡球菌菌落（参见附录B），移种到普通肉汤培养基中，置36℃士1培养20h24h.3.4.1.5取肉汤培养物0.3mmL.同0.5mL凝固酶试验免血浆于8mm×100mm试管内充分混合，置36℃工1℃培养，定时观察是香有凝块形成，至少观察6h，以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性，试验中需同时做已知阳性和阴性对照。对典型或可疑结果进行草兰氏染色，镜检和其他辅助试验「如：耐热核酸酶试验（参见附录C加以证实。3.4.2平板表面计数法
3.4.2.1适用于检查金黄色葡葡萄球菌数不小于10g或10mL的食品。3.4.2.2选3个连续稀释度，从每个稀释度分别取1mL稀释样液，接种至3个表面T燥的BP琼脂平板上(如;0.4ml0.3 ml0.3mL)。
3.4.2.3以「.形玻璃棒将接种物涂布丁琼脂表面，避免涂到平板边缘，将平板止置直牟接种物被培养基吸收，将平板翻转，36℃±1C培养45h~48h。3.4.2.4挑选有20个200个菌落的平板进行计数，如果有数种菌落皆类似金黄色葡萄球菌，则分别计算和记录每一类型的菌落数，当最低稀释度的平板的菌落数小于20时，仍可选用。如平板上的菌落数人丁200，其中有些菌落典型金黄色葡萄球菌的外观，同时在其高倍稀释度未出现典型菌落者：亦可用这些平板进行金黄色前萄球南计效，但不能把非典型菌落计算在内。3.4.2.5从可计数的各类型菌落中至少各选取2个以上典型或可疑菌落进行凝固酶试验，3.4.3定性检测法
3.4.3.1取1：10稀释的样品液10mL接种于10mL双料胰蛋白陈大豆肉汤中，36℃-1℃培养2h.
3.4.3.2再加人20mL含20%氯化钠的单料胰蛋白陈大豆肉汤，36℃1培养24h士2h。3.4.3.3取上述培养物0.2mL，分别涂布丁2个表面T燥的BP琼脂平板上，36℃=1℃培养46h土2h.
3.4.3.4从每个平板上至少挑取2个以上典型或可疑企黄色葡菊球菌荫落进行凝固酶试验。3.5结果的计算与报告
3.5.1最可能数（MPN）法的估算与报告3.5.1.1计算每个稀释样液得到的阳性反应管数。3.5.1.2若一管次培养物中所挑选的典型菌落中有一个为凝固酶阳性，则该供试培养物的管应视为阳性。
3.5.1.3根据所确认的阳性管数·用最可能微（MPN）表（见附录D）估算并报告每克或每毫升试样的金黄色葡萄球菌最可能数，以MPN/或MPN/InL报告。3.5.2平板表面计数的计算与报告一般原则
SV/T0172—2010
用所选择计数的每个平板工典型和可疑金黄色葡萄球菌的菌落总数，乘以相应平板上已确认为金黄色带药球菌的菌落数与所挑取的5个有代表性的菌落数之比，以此求出所选用的同·稀释度两个计数平板上的金黄色萄萄球菌菌落数并计算平均值，再乘以该稀释倍数.得出金黄色葡萄球菌CFU/g或CFL/mL。例如：在10-1样液的两个平板中分别有85个和80个菌落，而确认在5个菌落中分别有4个和3个为伞黄色葡萄球菌，那么每克或每掌升食品的金黄色葡萄球菌数为（85×4/5+80×3/5)/2×10-580
无特征性菌落
对于测试试样最低稀释度的两个平板上均无典型或可疑菌落，结果应报告小于1乘以最低稀释倍数CFU/g或CFU/ml.
3.5.3定性法报告
3.5.3.1报告阴性结果：末检出金黄色葡萄球菌/25g25ml.）3.5.3.2报告阳性结果：检山金黄色葡萄球菌/25g（25mL)htt
SN/T0172—2010
A.1一般要求
附录A
（规范性附录）
培养基与试剂
为保证培养基的质量，应按SN/T1538.1利SN/T1538.2进行培养基的制备与性能测试。若使用商售的脱水合成培养基，应选用国内外通过ISO900C质量体系认证生产厂商的产品并按其说明制备和使用。
普通肉汤培养基
牛肉膏
氯化钠
蛋凹陈
蒸馏水
A.2.2制法
将以上成分混合加热溶化，调至p117.1~7.6.分装试管，121\C高压火菌30minA.3胰蛋白陈大豆肉汤
A.3.1成分bZxz.net
胰蛋白陈
植物蛋白陈
氯化钠
磷酸氢一钾(K.HPO）
蒸馏水
A.3.2制法
1000.G rL
将各成分溶于蒸馅水中.必要时加热使完全溶解，分装于试管或玻瓶中，121C高压灭菌15Ⅱn.最终 pII7. 3+0, 2.
注：制条双料胰蛋门陈大豆肉汤时，除蒸溜水外，其他成分加倍。配制10元或20%氯化钠膜蛋白豚大豆肉汤时，可将氧化钠量增加至所需浓度。
Baird-Parker培养基
胰企陈
http:
酵母膏
丙醇酸钠
H氨鞍
氯化锂（LiC1·6H.O)
蒸馏水
A.4.2制法
SN/T 0172-2010
将各成分加于蒸留水中，加热煮沸使完全溶解，冷至25℃，调至pH7.0土0.2，分装每瓶95mL，121C高压火菌15min，临用时加热化琼脂，冷至50℃左右，于每95mL加人预热至50C的卵黄业碲酸钟增菌剂5mL。摇匀后倾注平-Ⅲ培养基，应是致密不透明的，使用前在冰箱贮存不得超过48h。A.4.3卵黄亚碲酸钾增菌剂配制
将新鲜鸡蛋浸泡在适当的氯化汞（Hgcl.）溶液（1100c）中约1min，以无菌摸作打开鸡蛋，使蛋黄与蛋分开，将蛋黄加于生理盐水中（30%）充分措勾，于50InL蛋黄乳液中加人10mL过滤除菌的1%亚稀酸钾水溶液，混匀，41赔存。A.5甲苯胺蓝-DNA琼脂
A.5.1成分
脱氧核糖核酸(DNA)
氯化钙（CaCL无水）
氯化钠
甲苯胺蓝（O)
三羟甲基氨基甲烷
蒸馏水
A.5.2制法
将二羟中基氨基中烷溶解于蒸馏水中，调至pH9.0，除中苯胺蓝(O)外将其余各项成分加热使溶解，再将中苯胺蓝（0)溶丁培养基中。分装于塞有橡皮塞的烧瓶中。如立即使用可不需灭菌。已灭菌的培养基在室温可存放4个月无变化，并经数次熔化后仍可使用：A.6
生理盐水
A.6.1成分
氨化销
蒸馏水
A.6.2制法
1 G00.c mL
将氯化钠溶于蒸馅水中，分装丁适当容器中，121C高压火菌15min5
合品伴风ht
SN/T0172—2010
凝固酶试验兔血浆
临用时取3.8%（取竹檬钠3.8g加蒸馆水100mL，待溶解后过滤，121C高压火菌15min）柠檬酸钠1份，加人新鲜免血4份，混匀后放冰箱中使用球沉降（或以3000g离心30min）后取上清液进行试验。也可采用等效的商品化凝固酶试剂。6
http：//foodmate.net附录B
（资料性附录）
典型或可凝金黄色葡萄球菌菌落SN/T 0172—2010
金黄色葡萄球菌的单个菌落在BP琼脂一平板上呈因形，表面光滑、凸起、湿润、直径2mm~3mm灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非自色）的边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰情：当用接种针触及菌落时具有黄油样粘感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同，从长期存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些且外观可能较粗糙，质地较十燥：http：//foodn
SN/T0172-2010
附录C
（资料性附录）
耐热核酸酶试验
C.1取3mI.甲苯胺蓝-I)NA琼脂平铺于载聆片上制成标本片。C.2待琼脂凝固后，在琼脂上打成直径2mm的小洞（每个载玻片1C个12个），抽出小洞中的琼脂块。
C.3加入约C.01mL加过热（在水浴中煮沸15min)的供凝固酶试验的肉汤培养物至所制各载玻片上的小河中
C.4将载玻片置湿室中，于35℃培养4hC.5阳性反应为在小洞周国形成至少扩展约1mm的浅粉红色的晕圈8
http：//foodn
matenet
附录D
（规范性附录）
金黄色萄萄球菌的最可能数（MPV）检索表每克（毫升）样品中最可能数（MPN）表！表D.1
阳性管数组合
MPV/g或MPN/mL
SN/T0172-2010
95%置信限
下限值
上限值
SN/T0172-2010
表D.1每克（毫升）样品中最可能数（MPN)）表（续）阳性管数组合
表内所处接种量如改用1.0g（ml.）.1g（mMPN/g或MFN/mt
95%置信限
下限值
上眼值
字应相应降低10倍；如改月0.01g（ml)0.301g（mL)0.0601g（ml)时.则表内数字应应增加70倍，其余类推18
全品伙伴网httn
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