【国家标准】 饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法

ICS 65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T 17818-—2010
代替GB/T17818—1999
饲料中维生素D3的测定
高效液相色谱法
Determination of vitamin Ds in feeds-High-performace liquid chromatography2010-09-26 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-01-01实施
本标准代替GB/T17818--1999《饲料中维生素D.的测定本标推与GB/T178181999主要差异如下：—-增加资料性附录 A；
一原标方法为第一法皂化提瑕法；高效液相色谱法》。
补充第二法直接提取法，适用于维生素预混料中维生素D的測定。本标准的附录 A 为资料性附录
本标出全国简料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)提出并归口。GB/T 17818-—2010
本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量督检验中心（北京）、北京桑普牛物化学技术有限公司、广东爱保农科技有限公司、帝斯曼维牛素（上海）有限公司、拜耳（四川)动物保健有限公司。本标摊主要起草人：赵小阳、施文娟、虞哲高、吴革华、李俊玲、李永才，张进、商军、郑秋蜂。本标准所代替标的历次版本发布情况为：-GB/T17818—1999.
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1范围
饲料中维牛素D的测定
高效液相色谱法
本标准规定了简料中维生素D，的高效液相色谱法测定。GB/T 17818—2010
本标准第-法适用于配合饲料、浓缩饲料、复介预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素D的测定，定量限为12.5μg/kg（500IJ/kg）。本标准第二法适用于维牛素预混合饲料中维生素D：的测定，定量限为125mg/kg(5×105IU/kg)。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标谁，然而，鼓励根据本标谁达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注口期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(G13/T6682分析实验室用水规格和试验方法GIB/T14699.1饲料采样
CB/T20195动物饲料试样的制备
3第一法皂化提取法
3.1原理
用碱溶液皂化试样，乙醛提取维生素D：，蒸发乙醚，残渣溶解于甲醇并将部分溶液注人高效液相色谱反相净化柱，收集含维生素D，琳洗液，蒸发至干，溶解于适当溶剂中，注人高效液相色谱分析柱，在264五丑处测定，外标法计算维牛素D，含量，3.2试剂和溶液
除特殊注明外，本标推所用试剂均为分析纯，水符合CB/T6682中三级用水规定，色谱用水符合GB/T6682中-级用水规定，溶液按照GB3/T603配制。3.2.1无水乙醚(不含过氧化物）3.2.1.1过氧化物检查方法：用5ml乙醚加1 ml.碘化钾溶液(3.2.9),振摇1 min,如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色，或加淀粉指示液(3.2.10)，水层呈蓝色。该乙醚需处埋后使用。3.2.1.2去除过氧化物的方法：乙醚用硫代硫酸钠溶液（3,2.11)振摇，静置，分取乙醚层，再用水振摇，洗涤两次，重蒸，弃去首尾5%部分，收集馏出的乙醚，冉检查过氧化物，应符合规定。3.2.2无水乙醇。
3.2.3止己烷：色谱纯。
3.2.41,4-二氧入环。
3.2.5甲醇：色谱纯。
3.2.62,G-二叔丁基对甲酚(BHI)。3.2.7无水硫酸钠。
3.2.8氮气(纯度 99.9%）。
碘化钾溶液：100g/L
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GB/T 17818—2010
淀粉指示液：5g/L(临用现配)。3.2. 10
硫代硫酸钠磷液：50g/1。
氢氧化钾溶液：500g/1。
3L-抗坏血酸乙醇落液:5 g/L,取0.5多L-抗环血酸结晶纯品溶解丁-4 mL温热的水中,用无水3.2. 13
乙醇3.2.2)稀释至100 mL,临用前配制酚酞指示剂：10g/1.。
氯化钠溶液：100g/1..
3. 2. 153
维生素D标准品：维生素ID，含量≥99.0%。3. 2. 16
维生素D：标准购备液：称瑕50mg维生素D（胆钙化醇）标准品（3.2.16)（精确室0.00001g）3.2. 17
于50mL棕色容量瓶中，用己烷溶解并稀释全刻度，混勾，4℃保存。该备液浓度为1.0mg/mL，3.2.18维牛素D.标准工作液：推确吸取维生素D标推贮备液（3.2.1.7),用正已烷（3.2.3)按1100比例稀释,若用反相色谱测延,将1.0mL维生素D:标准贮备液置入10mI.棕色容量瓶中,用氮气吹卡，用甲醇（3.2.5)稀释至刻度，混勾，再按比例稀释，该标准工作液浓度为10μg/mL。3.3仪器和设备
3.3,1分析天平，感量0.001 多。3.3.2分析天平，感量0.0001%。3.3.3分析天平，感量0.00001g。3.3.4圆底烧瓶，带回流冷凝器。3.3.5恒温水浴或电热套。
3.3.6旋转蒸发器。
3.3.7超纯水器。
3.3.8高效液相色谱仪，带紫外可调波长检测器（或极管矩阵检测器）。3.4采样
按照GB/T14699.1的规定执行。
3.5试样制备
按照GB3/T20195制备试样，磨碎，全部通过0.28mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，避光低温保存备用。
3.6分析步
3.6.1试样溶液的制备
3.6.1.1皂化
称敢试样，配合饲料10乌~20g，浓缩饲料10g，精确至0.001g，维牛素预混合饲料或复合预混合饲料 1 g~5 g,精确至 0. 000 1 g,置入 250 ml. 圆底烧瓶中,加 50 ml,~60 mI. L-抗坏血酸乙醇溶液（3.2.13），使试样究全分散，浸显，加10mL氢氧化钟溶液（3.2.12），混合均匀，置于水浴上回流30 min,不时振荡防止试样粘附在瓶壁[,皂化结束，分别用5 mL无水乙醇(3.2.2）,5nL水自冷凝管顶端冲洗其内部，瑕烧瓶玲却至约40℃。3. 6. 1. 2提取
定量转移全部皂化丁有100ml.无水乙醚（3.2.1)的500ml分液漏斗中，用30tnL~50rmL水分2次～3次冲洗圆底烧瓶并人分液漏斗，加盖、放气、随后混合，激烈振荡2min，静置分层，转移水相于第个分液漏斗中，分次用I001nI.、6mI.乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相，用氯化钠溶液（3.2.15)100mL洗涤次，用水每次100mL洗涤乙醚提收液至中性，初次水洗时轻轻璇摇，防Ⅱl:乳化。乙醚提取液通过,无水硫酸钠（3.2.7)脱水，转移到250ml.棕色容量瓶中，加100mgI3HT(3.2.6)使之溶解，用乙醚定容至刻度(V,)。以上操作均在避光通风柜内进行。2
3.6、1. 3浓缩
GB/T 17818-2010
从乙醚提取液（V1）中分取-定体积（V.)（依据样品标示量、称样量利提取液量确定分取最）置丁旋转蒸发器烧瓶中，在部分真空，水温度50℃的条件下蒸发至干，或用氮气吹于。渣用正已烷（3，2.3）溶解（需化时用甲醇溶解，按3.6.1.4进行），并稀释至10mI（V,）使其状得的溶液中每毫升含维生素L，2ug～10μg(80U~~400IU)，离心或通过0.45μm过滤膜过滤，收集清液移人2mL小试誉，用于高效液相色谱仪分析。以「媒作均在避光通风柜内进行。3.6.1.4高效液相色谱净化柱净化用5ml甲醇（3.2.5）溶解圆底烧瓶中的残渣，向高效液相色谱净化柱中注射0.5mI.甲醇溶液（按3.6.2.1所述色谱条件，以维生素D，标准甲醇溶液流出时间土0.5min）收集含维生素D.的馏分于50 mI.小容量瓶中,蒸发至干(或用氮气吹1),溶解于正已烷中。所测样品的维生素ID.标示量在每千克超过10000IU]范围时，可以不使用高效液相色谱净化柱，直接用分析柱分析。
3.6.2测定
3.6.2. 1离效液相色谱净化条件色谱净化柱:Lichrasorb RP-8,长 25 cm,内径 t0 mm,粒度 10 μm.流动相:甲醇+水(90十10)。
流速;2.0 mL/min.
温度：宰温。
检测波长：264nm
3.6.2.2高效液相色谱分析条件
3. 6.2.2. 1正相色谱
色谱柱：硅胶SiG0，长125mm，内径4.6mn,粒度5um（或性能类似的分析柱）。流动相：正已烷十1，4二氟六环(93十7）。流速:1. 0 tnI./min。
温度；室温。
进样量：20 μL。
检测波长：264nm。
3.6.2.2.2反相色谱
色谱柱：C.型柱，长125mm，内径4.6mm，粒度5μm（或性能类似的分析柱）流动相：甲醇十水95十5)。
流速:1. 0 mL/min,
温度：室温。
进样量：20μL。
检测波长:264 m。
3.6.2.3定量测定
按高效液相色谱仪说明[谢整仪器操作参数，为难确测量按要求对分析柱进行系统适应性试验，使维生素I，与维牛素T)，原或其他峰之间有较好分离度，其R1.5。向色谱柱注人相应的维生素，标准T.作液（3.2.18)租试样溶液（3.6.1），得到色谱峰积响应值，用外标法定量测定。3.6.2.4结果计算
3.6.2.4.1试样中维生素ID，的含量，以质量分数X，计，数值以国际单位每T-克（J.U/kg）或毫克每千克（tng/kg）表示，按式（1)计算：X, =PXV,×V,Xp ×1.25
P,Xm XV X fi
5×1000
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式中：
试样溶液（3.6.1)峰面积值；
提圾液的总体积，单位为毫升（mL）；试样溶液最终体积,单位为升(mIL.)；维生素D.标准工作液（3.2.18)浓度，单位为微克每亳升（ug/nL）；维生素D，标准工作液（3.2.18)峰面积值；试样质量,单位为克(g);
从提取液(V,)中分取的溶液体积，单位为毫升(mL)；转换系数，1国际单位（IU)维生素D，相当于0.025μg肥钙化醇。注：维生索D，对照品与试样同样启化处理所，所得标准溶液注入高效液相色谱分析耗以维素D，峰面积计算时可不乘1.25,
3.6.2.4.2平行测定结果用算术乎均值表示，保留三位有效数字。3. 6. 2. 5重复性
同一分析者对同·试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差见表1。表 1 相对偏差
维生索 Ds含重/(IU/kg)
1. 00X103 -1. 00X103
>1. 00 × 10* ~ 1. 00 ×105
>1.00×106
4第二法直接提取法
4.1原理
相对偏差/%
维生素预混合饲料中的维生素D用中醇溶液提取，试液注人高效液相色谱柱，在264找m处测定，外标法计算维生素D：含量。
4.2试剂和溶液
除特殊注明外，本标雅所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中二级用水规定，色谱用水符合GB/T6682中一级用水规定。
4.2.1维生素D标准品：维生素D，含最≥99.0%，4.2.2维生素D标准贮备液：称取维生素D,标准品（4.2.1)100mg（精确至0.00001g），于100mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.2.5)溶解并稀释至刻度，混匀，4℃保存。该贮备液浓度为1.0mg/ml.4.2.3维生素ID标准工作液：准确吸取维牛素D标准贮备液（4.2.2)1.0mL.于1.00mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.2.5)稀释至刻度，混勾，配制工作液浓度为10ug/mL。4.3仪器和设备
4.3.1超卢波水
4.3.2其他同3.3。
4.4采样
同3.1。
4.5试样制备
4.6分析步骤
4.6.1试样溶液的制备
称取试样1，精确至0.0001，置于100ml.的棕色容最瓶中，加入约80mI.的中醇，瓶塞不要拧全
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紧，于65℃超南波水浴中超声提取30 nin，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，充分揉勾，将溶液过0.45 μm滤膜,进样测定，使待测样品维生素D：的进样浓度与标准溶液浓度接近。4.6.2浏定
4.6.2.1色谱条件
色谱样:C型柱，长150nm，内径4.6mm，粒度5μm（或性能类似的分析柱）。流动相：甲醇卜水(98十2)。
流速:1.0 mL/min。
温度：室温。
进样最：20μL，
检测波长264nm。
4. 6. 2. 2定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱注入相应的维生素D，标准工作液（4.2.3）和试样溶液（4.6.1），得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定。维生素D，标谁色谱图参见图A.1。4.6.2.3结果计算
4.6.2.3.1试样中维生素D，的含量，以质量分数X，计，数值以国际单位每干克（1U/kg）或毫克千克(mg/kg)表示，按式(2)计算：式中：
P,×V×P×1. 07×1 000
P：试样溶液4.6.1)峰面积值；
V--试样落液（4.6.1)的总稀释体积，单位为亳升(mL)；p—维牛素D标准I.作液（4,2.3)浓度，单位为微克每毫升(μg/mI)；P·--维生素D，标准工作液（4.2.3)峰面积值；n2：试样质量,单位为克(g);
fz——转换系数，1国际单位(IU)维生素D，相当于0.025μg胆钙化醇；1.07——提取时生成预维生素D，的校正因子*(2 )
注：维生素D，标准品与试样同样处理后，所得标准溶液注人高效液相色讲分析柱以维生素T)，蜂面积计算时可不乘 1. 07.
4.6.2.3.2乎行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。4. 6.2. 4重复性
同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不人于10%。5
CB/T17818-2010
附录A
(资料性附录)
维生素 1).标准色谱图
892 -1
维生素D3标准色谱图
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打印H期：2010年12月15门F047
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词料中维生素D:的测定
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