【国家标准】 饲料中维生素a的测定高效液相色谱法

ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T17817—2010
代替GB/T17817—1999
饲料中维生素A的测定
高效液相色谱法
Determination of vitamin A in feeds-High-performance liguid chromatography2010-09-26发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2011-01-01实施
本标准代臂G13/T178171999&饲料中维牛素A的测定本标准与GB/T17817-1.999主要差异如下：-\-增加资料性附录A；
原标雅方法为第一法皂化提取法；高效液相色谱法》。
GB/T 178172010
补充第二法直接提取法，适用于维尘素预混介饲料中维生素A乙酸酯的测定。本标准的附录 A 为资料性附录。本标准出全国饲料I业标准化技术委员会(SAC/TC 76)提出并归口。本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心（北京）、北京桑普生物化学技术有限公司、广东爱保农科技有限公司、帝斯曼维生素（上海）有限公司、深圳市蛇口牡丹开发有限公司、广州立达尔生物科技有限公司。本标准主要起草人：赵小阳、施文娟、虞督高、吴革华、史瑞江、陶正国、陈小兵，李俊玲、李永才、张进、商军。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：.:*-G13/T 178171999。
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１范围
饲料中维生素A的测定
高效液相色谱法
GB/T 17817—2010
本标准规定了饲料中维生素A和维牛素顽混合饲料中维生素A乙酸醋的高效液相色谱法测定。本标准第一法适用于配合饲料、浓缩间料，复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维牛素A的测定，定量限为1000IU/kg。
本标准第一法适用于维生素预混合饲料中维生素A乙酸酯的测定，定量限为344mg/kg(10°IU/kg)。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用了本标准，GB/603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699,1饲料果样
GB/T20195动物饲料试样的制备
3第一法皂化提取法
3.1原理
碱溶液皂化试样后，用乙醚将维牛素A提取出来，蒸除溶剂，残渣溶于适当溶剂，注人高效液相色谱仪分离，在波长326 nm条件下测定,外标法计算维生素A含量。3.2试剂和溶液
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GB/I6682中三级用水规定，色谱用水符合GB/T 6682中一级用水规定，溶液按照CB/T603配制。3.2.1无水乙醚（不含过氧化物）3.2.1.1过氧化物检查方法：用5 tnL乙醚加1 ml,碘化钟溶液(3.2.9),振摇 1 min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色，或加淀粉指示液（3.2.10），水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。3.2.1.2去除过氧化物的方法：乙醚用硫代硫酸钠溶液（3.2.11)振播，静置，分取乙醚层，再用水振摇，洗涤两次，重蒸，弃去首尾5%部分，收集馏出的乙醚，再检查过氧化物，应符合规定。3.2.2无水乙醇。
3,2.3正口烷：色谱纯。
3.2.4异内醇：色谱纯，
中醇：色谱纯。
3.2. 6 2,6-二教」基对甲酚(BHT)。3.2.7水硫酸钠
3.2.8氮气（纯度99.9%）。
3.2.9碘化钾溶液：100g/L
3.2.10淀粉指示液：5 g/L.(临用现配),1
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GB/T 17817—2010
3.2.11 硫代硫酸钠溶液:50 g/L,3.2.12氢氙化钾溶液：500/1.
3. 2. 13L-抗坏血酸乙醇溶液:5 多/1.。取0. 5 g 1.-抗坏血酸结品纯品溶解于4 mL温热的水中.用无水乙醇(3.2.2)稀释至 100 mI.,临用前配制。3.2、14臀指示剂:10 g/L。
3.2. 15维牛素A乙酸酯标准品:维生素 A乙酸酯含量≥99.0%。3.2.16维生素 A标烂备液：称取维素 A乙酸标准品(3.2.15)34.4 tng(精确至 0. 000 01多)卡追化瓶中，按分析步骤（3.6)皂化和提取，将乙醚提取液全部浓缩蒸发至于，用正己烷解残渣置人100mL棕色容量瓶巾并稀释至刻度，混匀，4℃保存，该此备液浓度为344μg/mL（1000IC/mL），临用前用紫外分光光度计标定其推确浓度。3.2.17维牛素A标准工作液：确吸取1.001L维生素A标准贮备液（3.2.16）,用正已烷（3.2.3)稀释 100 倍;若用反相色谱测定,将 1.00 tml.维生素 A标准贮备液置人 100 m1.棕色容量瓶中,用氮气吹于，用甲醇（3.2.5）稀释至刻度，混勾，配制工作液涨度为3.44pg/mL（10IU/mL）3.3仗器和设备
3.3.1分析天，感量0.001g。
3.3.2分析天平，感量0.0001g
3.3.3分析天平，感量0.00001g。3.3.4圆底烧瓶，带回流冷凝器。3.3.5恒温水浴或电热套。Www.bzxZ.net
3.3.6旋转蒸发器。
3.3.7超纯水器。
3.3.8高效液相色谱仪，带紫外可调波长检测器（或一极管矩阵检测器）。3.4采样
按照GB/T14699,1的规定执行。
3.5试样制备
按照GB/T20195制备试样，磨碎，全部通过0.28mm孔筛，混勾，装入密闭容器中，避光低温保存备用。
3.6分析步骤
3.6.1试样溶液的制备
3. 6. 1.1皂化
称取试样配合饲料或浓缩饲料10g，精确至0.001多，维牛素预混合饲料或复合预混饲料1g～5 g,精确至0.000 1g,置人250 m.圆底烧瓶中,加50 tnL L-抗坏血酸乙醇溶液（3.2.13),使试样完全分散、浸湿,加10 mL氢氧化钾溶液(3.2.12),混勺。置于沸水浴[回流30 min,不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，宅化结束，分别用5mL无水乙醇（3.2.2）、5ml.水白冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却全约40C。
3.6.1.2提取
定量转移个部皂化液了盛有100mL无水乙醚（3.2.1）的500mL分液斗中，用30ml.~0ml.水分2次～3次冲洗圆底烧瓶并人分液满斗，加盖、放气、随后混，激烈振荡2min，静置、分层。转移水相于第：个分液瀚斗巾，分次用100mL.60mL乙醚重复提取两次，弃去水相，合并二次乙醚相。用水每次100t11。洗涤乙醚提瑕藏至中性，初秋水洗时轻轻旋探，防止乳化：乙醚提取液通过无水硫酸钠(3.2.7)脱水，转移到250mI.棕色容量瓶中，加100mgBHT（3.2.6)使之溶解，用乙酵疑容至刻度（V）。以上操作均在避光通风桓内进行。2
3,6. 1. 3浓缩
GB/T 17817—2010
从乙醛提取液（V，）中分取一定休积（V）（依据样品标小量、称样量和提取液量确定分取量）置于施转蒸发器烧瓶中，在水温度约50“），部分真空条件下蒸发至干或用氮气吹干，残渣用正已烧溶解（反相色谱用甲醇溶解）,并稀释至 10 m1.(V.>使其维生素 A最后浓度为每毫升 5 IU~10 IU,离心或通过0.45mm过滤膜过滤，用于高效液相色谱仪分析：以:操作均在避光通风内迹行。3. 6.2测定
3.6.2.1色谱条件
3.6.2.1.1正相色谱
色谱柱：硅胶 Si60,长125mm，内径4mm,粒度 5 μm(或性能类似的分析柱）流动相：止已烷十异丙醇（98+2)：流速：1.0mL/min;
温度：室温；
进样量：20z.；
检测波长：326nm。
3. 6. 2. 1. 2 反相色谱
色谱柱：C:型柱，长125mm,内径4.6 mm,粒度5μm(或性能类似的分析柱）;流动相；甲醇-+-水（95-5）；
流速:1.0 tnL/min;
温度：室温：
进样量：20：
检测波长：326ti。
3.6.2.2定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱注入相应的维生素A标准工作（3.2.17）和试样溶液（3.6.1)，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定，维生素A标准色谱图参见图A.13.6.2.3结果计算
3.6.2.3.1试样中维生素A的含量，以质量分数X,计,数值以国际单位每千克(IU/kg)或毫克每千克（mg/kg）表示，按式(1)计算：式中：
P×VX×P×1 000
P,Xm XV.Xf.
武样溶液（3.6.1)峰面积值；
提取液的总体积，单位为毫升(mI)；V，.一试样溶腋最整体积,单位为毫升（ml.);P-维生素^标准.I.作液(3.2.17)浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；Pz
维牛生素A标准T.作液(3.2.17)峰面积值；试样质量，单位为克(g)；
从提收液（V,)中分取的溶液体积，单位为毫升（mL）；(1)
f.-..转换系数，1国际单位（IU)相当于0.344μg维生素A乙酸醋，或0.300μ视黄醇活性。3.6.2.3.2平行测定结果用算术平均值表示,保留三位有效数字。3.6.2.4重复性
同··分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差见表1。3
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维生素 A 含量/(mg/kg)
1. 00X10* --1. 00×10*
1.00×104-~1.00×10
>1. 00×103~1. 00X10°
1, 00×106
4第二法直接提取法
4.1原理
表 1 相对偏差
和对偏差/%
维牛素预混料中的维生素A乙酸醋用甲醇溶液提取，试液注人高效液相色谱柱，在326 nm处测定,外标法计算维生素A乙酸醋含量。4.2试剂和溶液
除特殊注明外,本标准所用试剂均为分析纯，水符合GB/T 6682 中三级用水规定，色谱用水符合G13/\T6682巾-级用水规定。
4.2.1维生素A乙酸酯标准品，维生素A乙酸酯含量≥99.0%。4.2.2维生素A乙酸酯标准贮备液：称取维生素A乙酸酯标雅品（4.2.1)34.4mg（精确至0.00001g)，于100 mL棕色容量瓶巾，用甲醇（3.2.5)溶解并稀释至刻度，混勾，4 ℃保存。该贮备液浓度为344μg/mL(1000U/mL），临用前用紫外分光光度计标定其准确浓度。4.2.3维生素A乙酸酯标准工作液：准确吸取维生素A乙酸标准贴备液（4.2.2)1.0ml.于100ml棕色容量瓶中，用甲醇(3.2.5)稀释至刻度，混勾，配制工作液浓度为3.44μg/mlL(10IU/ml.）。4.3仪器和设备
4.3. 1超声波水浴。
4.3.2其他同3.3。
4.4采样
间3.4。
4.5试样制备
同3. 5。
4.6分析步骤
4.6.1试样溶液的制备
称取试样1名，精确至0.0001多，置于100ml.的棕色容量瓶中，加人约80mL的甲醇，瓶塞不要拧紧，于65℃超山波水浴中超声提取30min，冷却率室温，用甲醇稀释至刻度，充分摇。如果试样中维生素A乙酸酯的标示量低于10°IU/kg，则将溶液过0.45um滤膜，进样测定，否删需将溶液用中醇进-步稀释，使维生素A乙酸酯的进样浓度与维牛素A乙酸标准1.作液浓度接近。4.6.2测定
4.6.2.1色谱条件
色谱柱：Cl型柱，长150mm，内径4.6mm，粒度5热m（或性能类似的分析柱）；流动相：甲醇十水（98+2)：
流速：1.0mL/min；
温度：室温；
进样量；20μL：
检测波长：326nm，
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4.6.2.2定量测定
GB/T17817-—2010
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，间色谱住注入相应的维生素人乙酸酯标推工作液(4.2.3)和试样溶液(4.6.1),得到色谱峰面积响应值,用外标法定量测定，维牛:素A乙酸酯标准色谱图参见图A.2。
4.6.2.3结果计算
4.6.2.3.1试样中维生素A乙酸酷的含最，以质量分数X，计，数值以国际单位每千克（IU/kg)或毫克每千克（mig/kg）表示，按式（2)计算：PyXVxm
PXmXfz
式中：
P。——试样溶液(4,6.1)峰面积值;V试样溶液（4.6.1)的总稀释体积，单位为毫升(mL.)，p2
维牛素A乙酸酯标准工作液（4.2.3)浓度，单位为微克每毫乃(u名/mL）：P,—维生素 A 乙酸酯标准工作液(4. 2. 3)峰面积值;m
-试样质量，单位为克(g);
f2—转换系数,1 国际单位(IU)相当下0. 344 μg维生素 A乙酸酯。4.6.2.3.2平行测定结果用算术平均值表示,保留三位有效数字。4.6.2. 4重复性
同-分析者对同一-试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于10%。ht
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附录A
（资料性附录）
维生素 A、维生素 A 乙酸酯标准色谱图6
图 A. 1 维生素 A标准色谱围
2维生素 A乙酸酯标准色谱图
http：//www
GB/T 17817-2010
打印期：200年-12月151017
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国家标准
饲料中维生素A的测定
高效液相色谱法
GB/T 17817—2010
中国标准出版社出版发行
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印张0.75字数12下字
2010年11月第一版2010年11月第一次印刷*
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