【商检行业标准(SN)】 芦笋枯萎病菌检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2473—2010
芦笋枯萎病菌检疫鉴定方法
Identification of Fusarium oxysporumf.sp.asparagi2010-01-10发布
数码防伪
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-07-16实施
本标准的附录A、附录B和附录C均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2473—2010
本标准主要起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院，本标准主要起草人：程颖慧、章桂明、王颖、龙海、徐浪、郑耘、杨伟东、陈枝楠、谭彦彩。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。范围
芦笋枯萎病菌检疫鉴定方法
SN/T2473—2010
本标准规定了芦笋（AsparagusofficinalisLinn）种子及新鲜芦笋组织上的芦笋枯菱病菌（Fusari-umorysporumSchlecht.f.sp.asparagiCohen&Heald)的检疫和鉴定方法。本标准适用于对来自芦笋枯萎病疫区的芦笋种子和新鲜芦笋组织的检疫。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的用文件，其最新版本适用于本标准。SN/T1809进出境植物种子检疫规程，SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3原理
3.1分类学地位
英文名：FusariumWiltofAsparagus学名：FusariumorysporumSchlecht.f.sp.asparagi.CohenandHeald1941芦笋枯萎病菌属真菌界（Fungi)，有丝分裂孢子真菌[1]（Mitosporicfungi）、丝孢菌纲（Hyphomy-cetes），丛梗抱目（Monilales），瘤座孢科（Tubercufariaceae），镶刀菌属（Fusarium）。3.2鉴定原理
该真菌可以通过种子传播，其为害症状、形态特征、培养性状、寄主范围等特征是其鉴定的依据。依照这些特征能将该菌与其他真菌尤其是与芦笋上的其他致病镶刀菌区别开来。仪器和用具
4.1仪器
体视显微镜、光学显微镜（带显微照相装置）、测微尺、夫平（感量0.1g）、超净工作台、光照培养箱或光照培养架等。
4.2用具
紫外灯管、手持放大镜、滤纸、烧杯、培养血、三角瓶、锻子、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、酒精灯、吸管等。
5试剂和培养基
5.1试剂
琼脂粉、蔗糖、无菌水、1.25%次氯酸钠（NaCIO)、75%酒精、蛋白陈、磷酸二氢钾（KH2PO.）、硫酸镁（MgSO，·7H,O)、硫酸链霉素、硫酸新霉素、腈菌唑等。5.2培养基
马铃薯蔗糖培养基(PSA)、腈菌唑培养基（MBA)和马铃薯葡萄糖培养基(PDA）。现场抽样
按照SN/T1809及SN/T2122规定进行取样。SN/T2473—2010
7实验室检验
7.1症状检查
受侵染的植株的症状参见附录A第A.3章，7.2保湿培养
7.2.1种子保湿培养
将检验样品用有效成分为1.25%的次氯酸钠(NaClO)溶液表面灭菌3min～4min后，用灭菌水洗涤两次，放在挚有3层已灭菌湿滤纸的培养皿中，每Ⅲ10粒，在20℃～22℃下放置24h后，一20℃冷冻24h，转至25℃培养箱或培养架上培养，黑暗和紫外光照各12h交替，14d后观察种子上是否出现白色菌丝或霉状物。药剂处理过的种子需先洗去表面的种衣剂，再按照上述方法保湿培养。7.2.2新鲜植物组织保湿培养
取待检样品的茎切成1cm长的小段，冲洗掉表面的泥土杂物后，在75%的酒精溶液中浸泡1min，经灭菌水洗涤后，用灭菌解剖刀横切成长度为1mm～4mm的小片，放置在垫有3层灭菌湿滤纸的培养皿中，每皿5片～10片，转至25℃培养箱或培养架上培养，黑暗和紫外光照各12h交替，观察植物残体表面是否出现白色菌丝或霉状物。7.3分离培养性状
保湿培养发现疑似带病种子或组织，表面消毒后置于MBA培养基上，20℃黑暗条件下培养5d以上，培养基表面生长出白色菌丝，菌丝生长速度慢，菌落小。取MBA培养基上生长的培养物，置于PSA培养基上，20℃黑暗条件下培养4d～5d，气生菌丝绒状，白色、粉色至淡青色，基物表面淡青色。有时产生蓝绿色菌丝团。培养基配方参见附录B。7.4形态学特征
在显微镜下观查，苗丝体纤细，小型分生孢子着生于单出瓶状小梗上，假头状着生，通常生长茂盛，可变异，数量多，卵形至椭圆形，平直或弯曲，大小为（5μm～12μm）×（2.5μm～3.5μm）。大型分生孢子着生于分支的分生孢子梗上，薄壁，通常具有3个～5个分隔，镰型，具钩状的顶端，在基部有小柄，大小：3个分隔（27μm~46μm）×（3μm~5μm）；5个分隔（35μm~60μm）×（3μm~5μm）。厚垣孢子，间生或顶生，多单独生长，偶尔也可以对生或串生，球形，直径6μm～8μm。参见附录C。该病菌与其他几个近似种的形态学上的比较见表1。表1芦笋上的三种镰刀菌形态学特征比较表比较项目
培养性状
大型分生孢子
F.ozysporum f, sp.asparagi
培养4d～5d，菌落直径约
F.redolens
F.moniliforme
培养4d-5d，茜落直径约
气生菌丝绒状至粉状，菌落灰
2.5cm~4.5cm，气生菌丝绒
状，白色、粉色至淡青色，基物表面淡青色，基物无色。有时
产生蓝绿色菌丝团。
着生于分支的分生孢子梗上，
薄壁，通常具有3个～5个分
隔，镶型，具钩状的顶端，在基部有小柄，大小：3个分隔
(27μm~46μm）×（3μm~
5μm）；5个分隔（35μm~
60 μm)×(3 μm~5 μm)。
色至微红褐色或浅褐色，菌落
较平坦。
形成于分生孢子梗上或粘孢
团层上，镰刀型，有足细胞，人型分生孢子大小为（20μm～~
55 μm)×(4. 5 μm~5.5 μm)。3.2cm~4cm，气生菌丝绒状
至粉状，白色、至淡牵牛紫，有时产生桔橙色分生孢子座。
基物表面淡牵牛紫，培养基不
变色。
镰刀型，细长，项胞渐尖，基胞足跟明显至不明显，隔膜易消
解，3个～5个分隔，多数3隔，
(25 μm~55 μm)×(3 μm~
4.5 μm)。
比较项目
小型分生孢子
厚垣孢子
7.5致病性测定
F.orysporumf.sp.asparagi
着生于单出瓶状小梗上，假头
状着生，通常生长茂盛，可变
异，数量多，卵形至椭圆形，平直或弯曲，大小为（5μm～
12μm)×(2.5μm~3.5μm)。
间生或顶生，数量较多，多单
独生长，偶尔也可以对生或串
生，球形，直径6μm~8μm。
表1(续)
F.redolens
数量多，卵形或圆柱形，略微
弯曲，端部有节点。大小为
(7μm~14μm）×(3μm~
4 μm)。
间生或项生，球形或椭圆形，
直径7μm~11μm。
SN/T2473—2010
F.moniliforme
数量多，卵形至椭圆形，在产
孢细胞上中生，单瓶梗，也有
假头生，（7μm~15μm）×
(2 μm~3 μm)。
未见。
将粟米与水(2：1，体积比)连续湿热灭菌两次，每次1h，冷却后接种分离物于其中，20℃培养3周风干，加入土中（1kg土壤中加8g栗米培养物)拌匀，种植苗龄为13周的芦笋幼苗于其中，20℃、9h光照条件下种植8周后，检查植株有无发病，并再次从病部分离病原菌，观察其形态是否与7.4一致。8结果判定
如分离物的各种形态特征与7.3、7.4描述的芦笋枯萎病菌培养性状和形态特征相吻合，且致病性测定结果符合芦笋枯萎病症状特征且重新分离获得的病原菌形态学特征与7.4描述吻合，可判定为芦笋枯萎病菌。
样品保存
如发现芦笋枯萎病菌，该样品至少保存6个月，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，需经灭菌处理。免费标准bzxz.net
10菌种保存
分离到的芦笋枯萎病菌菌种，转人PDA试管斜面培养基上，置于5℃黑暗条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁。
SN/T2473—2010
A.1分布
附录A
(资料性附录）
芦笋枯萎病菌的分布、寄主、症状及生物学特性德国、荷兰、法国、意大利、比利时、西班牙、希腊、坦桑尼亚、南非、澳大利亚、新西兰、加拿大、美国、日本、中国（台湾)。
A.2寄主
芦笋（Asparagusofficinalis
A.3症状
发病植株表现为黄化矮小、凋娄而枯死、病菌侵染芦笋的营养根，表皮呈红棕色病斑或者凹陷的褐色病斑，根茎部维管束变褐色，地面植株上部呈黄化、矮化、凋萎、落叶或枯死状。幼笋期染病，幼笋细小或难以出土，嫩茎染病，茎基部变褐或纵裂，拟叶凋萎。潮湿时表面出现白色至粉红色薄霉层病征（病菌分生孢子梗及分生孢子）。
A.4生物学特征
病菌依靠带菌种子、种苗和病残体进行远距离传播，在田间主要通过芦笋潜叶蝇（Ophiomyia sim-plez）、风雨和流水进行传播。病原菌长期栖息于≠中，能大量繁殖，抗逆性强。通过寄主植株根部自然孔口或伤口侵染植株，发病后产生大量的分生孢子进行再侵染。B.1MBA培养基配方（1L）
蛋白陈20g
磷酸二氢钾(KH,PO.)1g
硫酸镁（MgSO。·7H,O)0.5
琼脂20g
附录B
（资料性附录）
培养基配方
硫酸链霉素（streptomycinsulphate)1oomg硫酸新霉素（neomycinsulphate)12.mg腈菌唑（myclobutanil)200mg
B.2PSA培养基配方(1L)
马铃薯200g
蔗糖20g
琼脂20g
B.3制作方法
SN/T2473—2010
将配方中的各成分加水煮沸溶解后：补水至1,000mL.pH值调到7.2～7.4.分装后121℃15lb湿热灭菌20min。
SN/T2473—2010
一大型分生孢子；
一小型分生孢子：
厚垣孢子；
产孢细胞。
陈鸿遠，1992）
附录C
(资料性附录）
F.oxysporum形态特征图
图C.1F.oxysporum形态特征图
10 μm
SN/T2473-2010
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
芦笋枯萎病菌检疫鉴定方法
SN/T2473—2010
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址www.spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印剧*
开本880×12301/16
2010年4月第一版
印张0.75字数13千字
2010年4月第一次印剧
印数1-1600
书号，155066·2-20706
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