【国家标准】 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验

ICS07.100
中华人民共和国国家标准
GB15193.6—2003
代替GB15193.6—1994
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验Mammalian bonemarrow cell chromosomeaberrationtest
2003-09-24发布
2004-05-01实施Www.bzxZ.net
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
GB15193.6—2003
本标准全文强制。
本标准代替GB15193.6-1994《骨髓细胞染色体畸变试验》。本标准与GB15193.6—1994相比的主要修改如下：-将标准名称“骨髓细胞染色体畸变试验”改为“哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验”；在“范围”中增加了受试物的具体内容：食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等；增加不适用范围：将原操作步骤中“5.1动物处理”标题下的有关内容分列为：“试验动物”“剂量及分组”和“搬作步骤”三章；
增加章题“试验动物”，将“取健康成年大、小鼠”改为“常用健康年轻的成年大鼠或小鼠”，-增加章题\剂量及分组”，并将高剂量组的设计方法增加一条“急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）求不出LDsc时，高剂量组则按以下顺序：a）10g/kg体重；b）人的可能摄人量的100倍；或c）一次最大灌胃剂量进行设计”，增加参考阳性对照物丝裂霉素C(1.5mg/kg体重~2.0mg/kg体重），或环磷酰胺（40mg/kg体重）；将原\5.1.2\剂量设计以外的内容放在增加的“操作步骤”标题下，并在此标题下增加\受试物配制”的有关内容；
—增加“结果判定”内容。
自本标准实施之日起，GB15193.6—1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、哈尔滨医科大学、杭州市卫生防疫站。
本标准主要起草人：韩驰、店玲光、袁振华。本标准于1994年首次发布，本次为第次修订。50
1范围
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验GB15193.6—2003
本标准规定了哺乳动物骨髓染色体畸变试验的基木技术要求。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素对大、小鼠骨髓细胞的遗传毒性，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。本标准不适用于有证据表明受试物或反应代谢产物达不到靶组织（targettissue)—骨髓的情况。2原理
染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，当化学物质作用于细胞周期G1期和S期时，诱发染色体型畸变，面作用于G2期时则诱发染色体单体型畸变。给试验的大、小鼠腹腔注人秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，以便增加中期分裂相细胞的比例，并使柒色休丝缩短、分散，轮廊清晰。在显微镜下观察染色体数目和形态。3仪器与试剂
全部试剂除注明外均为分析纯，试验用水为蒸馏水。3.10.1%秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱保存。3.22.2%柠檬酸钠。
3.3PH7.4磷酸盐缓冲液。
3.3.11/15mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠（NazHPO,）9.47g溶于1000mL蒸馏水中。3.3.21/15mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾（KH,PO,)49.07g溶于1000mL蒸馏水中。3.3.3将磷酸氢二钠溶液80ml.与磷酸二氢钾溶液20ml.混合，用pH计测定并调节pH至7.4。3.40.075mol/L氟化钾溶液。
3.5甲醇（分析纯）：冰乙酸（分析纯）以3：1混合，临用时现配。3.6Giemsa溶液。
3.6.1Giemsa储备液：取Giemsa染料3.8g，玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨，逐渐加甲醇至375mL。溶解后再加125mL纯甘油，于37℃温箱保温48h，在此期间摇动数次，放置1周～2周过滤备用。3.6.2Giemsa应用液：取1mL储备液加人10ml.pH7.4磷酸缓冲液。3.7仪器与设备：实验室常用设备、慎温水浴锅（37℃士5℃）、离心机、生物显微镜。4实验动物
常用健康年轻的成年大鼠或小鼠。每纽用两种性别的动物至少各5只。动物购买后适应环境至少3天。
5剂量及分组
受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2LD，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4和1/8LD作为中、低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出LD时，高剂量组则按以51
CB15193.6—2003
下顺序：a）10g/kg体重，b）人的可能摄入量的100倍；或c）一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。另设溶剂对照组和阳性对照组，阳性物可用丝裂素C(1.5mg/kg体重～2.0mg/kg体重）或环磷酰胺（40mg/kg体重）经口或腹腔注射（首选经口）给予。6操作步骤
6.1受试物配制
一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素配成乳浊液或悬浊液。受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊液等）保存具有稳定性。6.2实验动物的处理
经口给予受试物2次～4次，每次间隔24h，在末次给受试物后18h～24h取材。必要时可先用一个剂量的3只动物，于给受试物后6、24、48h分别处死动物取材，以选择处死动物的最适时间。在一次给受试物时也可每个剂量组用15只动物，于6、24、48h后分别各处死5只动物取材。处死动物前2h～4h，按4mg/kg体重胶腔注人秋水仙素。大鼠断头处死，小鼠颈椎脱白。6.3标本制备
6.3.1取材
取股骨，去附着的肌肉，剪去两端骨，用带针头的注射器吸取2mL～4mL2.2%柠檬酸钠溶液，将骨髓洗人10mL离心管中，反复冲洗数次直至股骨断面由红色变粉色，然后以1000/min～1500r/min离心10min，弃去上清液。6.3.2制片
离心后的沉淀物加人4mL0.075mol/L氧化钾溶液，混勾后在37℃水浴或恒温箱中放置10min~20min，再以1000r/min～1500r/min离心，弃去上清液。将新配制的甲醇-冰乙酸固定液4mL沿管壁加人受试物中，10min～15min后，用吸管将细胞团块打碎继续固定10min15min，以1000r/min离心10min弃去上清液，再加固定液4mL静置20min后离心，弃去上清液，用吸管混匀制成0.5mL~1.0mL细胞悬液。先将洗净的载玻片保存于冰水中备用。自冰水中取出载玻片，倾斜30℃放置，立即吸取细胞恐液在玻片的1/3处滴3滴，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个标本制2张～3张玻片，空气中自然干燥。
临用时取Giemsa储备液1mL，磷酸盐缓冲液10mL，置染色缸中，将涂片浸于染液中染色15min左右，取出玻片用水冲洗，空气中自然干燥。6.4阅片
6.4.1阅片要求
在低倍镜下检查制片质量，制片应为全部染色体较集中，而各个染色体分救、互不重叠、长短收缩适中、两条单体分开、清楚地显示出着丝点位置、染色体呈红紫色。用油镜进行细胞中期染色体分析。每只动物分析100个中期相细胞，每个剂量组不少于1000个中期相细胞。6.4.2观察项目
6.4.2.1染色体数目的改变
6.4.2.1.1非整倍体：亚二倍体或超二倍体。6.4.2.1.2多倍体：染色体成倍增加。6.4.2.1.3内复制：包膜内的特殊形式的多倍化现象。6.4.2.2染色体结构的改变
6.4.2.2.1断裂：损伤长度大于染色体的宽度。6.4.2.2.2微小体：较断片小而呈圆形。6.4.2.2.3有着丝点环：带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。52
6.4.2.2.4
无着丝点环：成环状结构。
6.4.2.2.5单体互换：形成三辐体、四辐体或多种形状的图像。6.4.2.2.6双微小体：成对的染色质小体。6.4.2.2.7裂隙：损伤的长度小于染色单体的宽度。6.4.2.2.8非特定性型变化：如粉碎化、着丝点细长化、粘着等。7
数据处理
统计学处理用Xx?检验。
8结果判定
GB15193.6—2003
试验组与对照组相比，试验结果染色体畸变率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则应进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。