【国家标准】 急性毒性试验

ICS07.100
中华人民共和国国家标准
GB15193.3—2003
代替GB15193.3—1994wwW.bzxz.Net
2003-09-24发布
Acute toxicity test
试丨验
2004-05-01实施
中华人民共和国卫生部
中国国家标化管理委员会
GB15193.3—2003
本标准全文强制。
本标准代替GB15193.3-1994《急性毒性试验》。本标准与GB15193.3—1994相比修改如下：在范围中增加了受试物的具体内容：食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等；-对\实验动物”内容的修订：将“成年小鼠和大鼠”改为”成年大鼠或/和小鼠”；在“操作步骤中删除了原4.2.4内容中\如估计受试物的毒性很低或溶解度很低者，但只须剂量达到10g/kg体重仍不引起动物死亡，即可停止再进行更多次的给予”；在几种常用的急性性试验设计方法（原4.3方法）中，增加一个试验方法“最大耐受剂量法”，
附录A中，表A.1中可信限的第17行“4.94～1.67\改为“4.94～16.7”；删除了附录G\急性毒性半数致死量（IDs。）结果报告表”。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录。自本标准实施之日起，GB15193.3—1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、南京医学院。本标准主要起草人：戴寅、马风楼、郭世萍。本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。18
1范围
急性毒性试验
GB15193.3—2003
本标准规定了急性毒性试验的基本技术要求。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的急性毒性作用。检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。2.1
半数致死盘medianlethaldose，LDso是经口给予受试物后，预期能够引起动物死亡率为50%的单一受试物剂量，该剂量为经过统计得出的估计值。其单位是每干克体重所摄人受试物质的毫克数，克数或毫升数，印mg/kg体重、g/kg体重或mL/kg体重。
最大耐受剂盘法testofmaximumtolerateddose用最大使用浓度和最大灌胃容量给予20只动物后，连续观察7关～14天，未见任何动物死亡，则MTD大于X×g/kg体重。
3原理
经口一次性给予或24h内多次给予受试物后，在短时间内观察动物所产生的毒性反应，包括致死的和非致死的指标参数，致死剂量通常用半数致死剂量I.D来表示。4实验动物
一般均分别用两种性别的成年小鼠或/和大鼠。小鼠体重为18g～22g，大鼠体重为180g～220g。如对受试物的毒性已有所了解，还应选择对其敏感的动物进行试验，如对费曲素选择维鸭，对氰化物选择鸟类。动物购买后适应环境3天～5天。5操作步骤
5.1受试物的处理
受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中。一般采用水或食用植物油作溶剂，可以考虑用羧甲基纤维素、明胶、淀粉等配成混悬液：不能配制成混悬液时，可配制成其他形式（如糊状物等）。必要时可采用二甲基亚砜。但不能采用具有明显毒性的有机化学溶剂。如采用有毒性的溶剂应单设溶剂对照组观察。5.2受试物的给予
5.2.1途径：经口。
5.2.2试验前空腹：动物应隔夜空腹（一般禁食16h左右，不限制饮水）。5.2.3容量：各剂量组的灌胃容量相同（ml/kg体重），小鼠常用容量为0.4ml/20g体重；大鼠常用容量为2.0mL/200g体重。
GB15193.3—2003
5.2.4方式：一般一次性给予受试物。也可一日内多次给予（每次间隔4h～6h，24h内不超过3次，尽可能达到最大剂量，合并作为一次剂景计算）。5.3几种常用的急性毒性试验设计方法5.3.1霍恩氏（Horn）法
5.3.1.1预试验
可根据受试物的性质和已知资料，选用下述方法：一般多采用10，100和1000mg/kg体重的剂量，各以2只～3只动物预试。根据24h内死亡情况，估计LDs的可能范围，确定正式试验的剂量组。也可简单地采用一个剂量，如215mg/kg体重，用5只动物预试。观察2h内动物的中在表现。如症状严重，估计多数动物可能死亡，即可采用低于215mg/kg体重的剂量系列，反之症状较轻，则可采用高于此剂量的剂量系列。如有相应的文献资料时可不进行预试。5.3.1.2动物数
一般每组用5只。
5.3.1.3常用剂量系列
t=0，±1.±2，±3
因为剂量间距较3.16
×10°，t=0，士1，士2，士3为小，所以结果较为精确。一般试验时，可根据上述剂量系列设计5个组，即较原来的方法在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组，这样在查表时容易得出结果。
5.3.1.4正式试验
将动物在实验动物房饲养观察3天～5天，使其适应环境，证明其确系健康动物后，进行随机分红。给予受试物后一般观察7天或14天，若给予后的第4天继续有死亡时，需观察14天，必要时延长到28天。记录死亡数，查表求得IDo，并记录死亡时间及中毒表现等。5.3.1.5该方法的优缺点
优点是简单易行，节省动物；缺点是所得LD的可信限范图较大，不够精确。但经多年来的实际应用与验证，同一受试物与寇氏法所得结果极为相近。因此对其测定的结果应认为是可信与有效的。5.3.2寇氏（Korbor）法
5.3.2.1预试验
除另有要求外，一般应在预试中求得动物全死亡或90%以上死亡的剂量和动物不死亡或10%以下死亡的剂量，分别作为正式试验的段高与最低剂量。5.3.2.2动物数
除另有要求外，一般设5个～10个剂量组，每组6只～10只动物为宜。5.3.2.3剂量
将由预试验得出的最高、最低剂量换算为常用对数，然后将最高、最低剂量的对数差，按所需要的组数，分为几个对数等距(或不等距)的剂量组。5.3.2.4试验结果的计算与统计
5.3.2.4.1列试验数据及其计算表包括各组剂征（mg/kg体重，g/kg体重），剂量对数（X），动物数（n），动物死亡数（r），动物死亡百分比（P，以小数表示），以及统计公式中要求的其他计算数据项目。5.3.2.4.2LDso的计算公式
根据试验条件及试验结果，可分别选用下列三个公式中的一个，求出logLDso，再查其自然数，即LDso（mg/kg体重，g/kg体重）。20
5.3.2.4.2.1按本试验设计得出的任何结果，均可用式（1)。logl.D=Z(X, + X) (P1-P,)
式中：
X,与Xi+I及P+I与P,-
分别为相邻两组的剂量对数以及动物死亡百分比。5.3.2.4.2.2按本试验设计且各组间剂量对数等距时，可用式（2)。logLDs XK-
式中：
XK——最高剂量对数，其他同式(1)。兴(P+P)
GB 15193.3--2003
·（1)
·（2）
5.3.2.4.2.3若试验条件同5.3.2.4.2.2且最高、最低剂量组动物死亡百分比分别为100（全死）和0（全不死时），则可用便于计算的式（3）。logLD=XK-d(ZP-0.5)
式中：
ZP—各组动物死亡百分比之和，其他同式（2)。5.3.2.4.3标准误与95%可信限
5.3.2.4.3.1logLD的标准误（S)：SiogLDra
5.3.2.4.3.295%可信限（X）：
ZP(1-P)
X = log-1(logLDn ± 1. 96 - SiogLD.a)（3）
.（4)
（5）
此法易于了解，计算简便，可信限不大，结果可靠，特别是在试验前对受试物的急性毒性程度了解不多时，尤为适用。
5.3.3机率单位
-对数图解法
5.3.3.1预试验
以每组2只～3只动物找出全死和全不死的剂量。5.3.3.2动物数
一般每组不少于10只，各组动物数量不一定要求相等。5.3.3.3剂量及分组
一般在预试得到的两个剂量组之间拟出等比的六个剂量组或更多的组。此法不要求剂量组间呈等比关系，但等比可使各点距离相等，有利于作图。5.3.3.4作图计算
5.3.3.4.1将各组按剂量及死亡百分率，在对数概率纸上作图。除死亡百分率为0%及100%者外，也可将剂量化成对数，并将百分率查概率单位表得其相应的概率单位作点于普通算术格纸上，0%及100%死亡率在理论上不存在，为计算需要：0%改为0.25×100%，
100%改为(N-0. 25)×100%
N为该组动物数，相当于0%及100%的作图用概率单位。5.3.3.4.2划出直线，以透明尺日测，并照顾概率。5.3.3.5计算标准误
SE=2SN2N
式中：
N—概率单位3.5～6.5之间（反应百分率为6.7～93.7之间）各组动物数之和；（6）
GB15193.3—2003
SE—标准误；
2S——LDg与LD1之差，即2S=Dg4LD1s（或EDg4—ED）。相当于LD及LDr的剂量均可从所作直线上找到。也可用普通方格纸作图，查表将剂量换算成对数值，将死亡率换算成概率单位，方格纸横坐标为剂量对数，纵坐标为概率单位，根据剂量对数及概率单位作点连成线，由概率单位5处作一水平线与直线相交，由相交点向横坐标作一垂直线，在横坐标上的相交点即为剂量对数值，求反对数致死量（LDs。）值。5.3.4最大耐受剂量法
5.3.4.1适宜条件：有关资料品示毒性极小的或未显示毒性的受试物，给予动物最大使用浓度和最大灌胃容量时，仍不出现死亡。
5.3.4.2动物：至少雕、雄各10只。5.3.4.3剂量：受试物最大使用浓度和灌胃体积（一个剂量组）。5.3.4.4方法：动物购买后观察3天～5天，给予最大使用浓度和最大灌胃容量的受试物（一日内1次或多次给予，一日内最多不超过3次），连续观察7天14天，动物不出现死亡，则认为受试物对某种动物的经口急性毒性最大耐受剂鼠大于某一数值（g/kg体重）。最大灌胃容量小鼠为0.4mL/20g体重，大鼠为4.0mL/200g体重。
5.3.5急性联合毒性试验
5.3.5.1原理
两种或两种以上的受试物同时存在时，可能发生作用之间的抗、相加或协同三种不同的联合方式，可以根据一定的公式计算和判定标准来确定这三种不同的作用。5.3.5.2步骤
5.3.5.2.1分别测定单个受试物的LDso，方法同前。5.3.5.2.2按各受试物的LDs值的比例配制等毒性的混合受试物。5.3.5.2.3测定混合物的LD，用其他LDsa测定方法时，可以按各个受试物的LDs值的二分之一之和作为中组，然后按等比级数间上、下推算几组，与单个受试物LD测定的设计相同，如估计是相加作用，可向上，下各推算两组，如可能为协同作用，则可向下多设几组；如可能为拮抗作用，则可向上多设几组。
5.3.5.3计算
5.3.5.3.1泥合物中各个受试物是以等毒比例混合的，因此求出的LDs。乘以各受试物的比例，即可求得各受试物的剂量。
5.3.5.3.2用式（7)计算混合物的预期LDs值的比值，按比值判定作用的方式。混和物的预期T.D。值一受试物A的LD宿+受试物B的LD值+……+受试物N的LD。值（7）
式中：
a...nA,B..…N各受试物在混合物中所占的质量比例，a+b+.+n=l。5.3.5.3.3判定受试物联合作用方式的比值采用Smith.H.F的规定，即小于0.4为拮抗作用，0.4～2.70为有相加作用，大于2.7为有协同作用。5.4中毒反应观察
给予受试物后，邸应观察并记录实验动物的中毒表现和死亡情况。观察记录应尽量准确、具体、完整，包括出现的程度与时间。对死亡动物可作大体解剖。6结果评价
根据LDs。数值，判定受试物的毒性分级。由中表现初步提示毒作用特征。22
附录A
（规范性附录）
崔恩氏法（Horn）LDs值计算（剂盘递增法测定LDso计算用表）GB15193.3—2003
A.1表A.1用于每组5只动物，其剂量递增公比为V10，意即10×/10=21.5，21.5×V10=46.4··，余此类推。此剂量系列排列如下：10.07
组3组4
组2组4
剂量1=0.4641
剂量2=1.00
剂量3=2.15
剂量4=4.64
可信限
1.37~2.91
t0,±1,±2±3..
剂量1=1.00）
剂量2-2.15
剂量3=4.64
剂量4=10.0
1.26~2.33
1.23~3.24
1.05~2.78
0.9512.27
0.9261.71
1.01~2.91
0.862~2.50
0.775~2.05
0.741~1.57
0.740~2.14
0.665~1.75
1.22~3.14
1.07~2.43
1.05~1.70
1.06~3.60
0.866~3.01
0.737~2.41
0.661~1.83
0.818~3.19
0.658~2.70
可信限
2.95~6.26
2.71~5.01
2.65~6.98
2.27~5.99
2.05~4.88
2.00~3.69
2.17~6.28
1.86~5.38
1.69~4.41
1.60~3.99
1.59~4.62
1.43~3.78
2.63~6.76
2.31~5.24
2.26~3.65
2.29~7.75
1.87~6.49
1.59~5.20
1.42~3.95
1.76~6.37
1.42~5.82
剂量1-2.15
剂量2=4.64
剂量3=10.0
剂量4=21.5
可信限
6.36~13.5
5.84~10.8
5.70~15.0
4.89~12.9
4.30~7.94
4.67~13.5
4.00~13.5
3.60~9.50
3.44~7.30
3.43~9.95
3.08~8.14
4.98~11.3
4.87~7.87
4.94~16.7
4.02~16.7
3.42~11.2
3.07~8.51
3.80~14.8
3.05~12.5
GB15193.3—2003
组2组3组4
组3组2
剂量1=0.464
表A.1（续）
剂量1-1.00
剂量2-1.00
剂量3=2.15
剂量4=4.64）
可信限
0.550~2.20
0.523~2.32
1.00~3.58
0.806~2.67
0.674~1.92
0.839~4.29
0.616~3.50
0.466~2.77
0.573~3.76
0.406~3.18
1.18~3.26
1.27~2. 05
0.978~3.92
0.893~2.92
0.885~2.01
0.9304.12
0.797~3.28
0.715~2.49
0.686~1.77
0.676~2.63
0.599~2.02
0.9693.71
1.02~2.11
0.757~4.75
0.654~3.30
0.581~2.22
0.706~5.09
0.564~3.82
0.454~2.85
0.423~3.05
0.662~4.78
剂量2=2.15
剂量3=4.64
剂量4=10.0元
可信限
1.19~4.74
1.13~4.99
2.16~7.71
1.74~5.76
1.45~4,13
1.81~9.23
1.33~7.53
1.00~5.98
1.24~8.10
0.875~6.85
2.53~7.02
2.74~4.42
2.11~8.44
1.92~6.30
1.91~4.33
2.00~8.88
1,72~7,06
1.54~ 5. 36
1.48~3.80
1.46~5.67
1.29~4.36
2.20~4.54
1.63~10.2
1.41~7.10
1. 25 ~4. 79
1.52~11.0
1.21~8.24
0.977~6.13
0.9126.57
1.43~10.3
剂量1=2.15
剂量2=4.64
剂3-100
剂量421.5
可信限
2.55~10.2
2.43~10.8
4.66~16,6
3.13~8.89
3.89~19.9
2.86~16.2
2. 66 ~17. 4
1.89~14.8
5.46~15.1
5.90~9.53
4. 54~18.2
4.14~13.6
4.11~9.33
4.31~19.1
3.70~15.2
3.32~11.5
3.14~12.2
2.78~9.39
4.50~17.2
4.74~9.78
3.51~22.0
3.03~15.3
2.70~10.3
2.62~17.7
2.11~13.2
1.97~14.2
3.07~22.2
组2组3
剂量1=0.464
剂量21.00
剂盘3=2.15
剂4=4.64，
表A.1（续）
剂量1=1.00
可信限
0.583~2.52
0.455~6.95
0.327~4.48
0.410~7.72
0.266~5.52
1.12~3.20
0.777~4.63
0.806~2.67
0.678~5.30
0.616~3.50
0.602~2.15
0.573~3.76
0.5032.57
0.856~3.69
0.481~6.58
0.451~3.25
0.390~8.11
0.310~4.74
0.279~5.26
剂量2=2,15
剂量3-4.64
剂量4=10.0
可信限
1.26~5.42
0.98015.0
0.705~9.66
0.883~16.6
0.573~11.9
1.67~9.97
1.46~11.4
1.33~7.53
1.30~4.62
1.24~8.10
1.08~5.54
1.85~7.96
1.04~14.2
0.9727.01
0.840~17.5
0.668~10.2
0.602~11.3
GB15193.3—2003
剂量1-2.15
剂量2=4.64
剂量3-10.0
剂量4=21.5
可信限
2.71~11.7
2.11~32.3
1.52~20.8
1.90~35.8
1.23~25.6
5.22~14.8
3.60~21.5
3.74~12.4
3.15~24.6
2.86~16,2
2.79~9.96
2.66~17.4
2.33~11.9
3.98~17.1
2.23~30.5
2.09~15.1
1.81~37.6
1.44~22.0
1.30~24.4
A.2表A.2用于每组5只动物，其剂量递增公比为V10，意即10×V10=31.6，31.6×V10=100…，余此类推。此剂量系列可排列如下1.001
组1组2组3组4
组3组2组4
剂量1=0.316
剂量2=1.00
剂量3=3.16
剂量410.0
t0，±1，±2，±3.....
刻量1=1.00
剂量2-3.16
可信限
1.60~4.95
1.41~3.55
剂量3=10.0
剂4=31.6
可信限
5.07~15.7
4.47~11.2
GB15193.3—2003
组2组3
表A.2（续）
剂量1=0.316
剂量2=1.00
剂量3=3.16
剂量4-10.0
可信限
1.36~5.84
1.08~4.64
0.927~3.41
0.891~2.24
0.801~3.95
0.682~2.93
0.638~1.97
0.636~3.14
0.5422.32
1.35~5,56
1.11~3.80
1.07~2.21
1.10~6.82
0.806~5.23
0.632~3.75
0.537~2.48
0.740~5.70
0.534~4.44
0.408~3.27
0.378~3.53
1.01~6.77
0.723~4.37
0.554~2.65
0.768~8.87
0.484~6.53
0.318~4.62
0.434~7.28
0.259~5.67
1.27~5.88
剂量1=1.00
剂量2=3.16
剂量3=10.0
剂量4=31.6
可信限
4.30~18.5
3.42~14.7
2.93~10.8
2.82~7.08
3.19~15.7
2.53~12.5
2.16~9.25
2.02-6.24
2.01～9.92
4.26~17.6
3.51~12.0
3.40~6.98
3.48~21.6
2.00~11.9
1.70~7.85
2.34~18.0
1.69~14.1
1.29~10.3
1.20~11.2
3.18~21.4
2.29~13.8
1.75~8.39
2.43~28.1
1.53~20.7
1.00~14.6
1.37~23.0
0.819~17.9
4.03~18.6
组2组3
表A.2(续）
剂量1=0.316
剂量2=1.00
剂量3=3.16
剂量4=10.0
可信限
1.43~2.94
0.968~7.75
0.843~5.00
0.833~2.85
0.896-8.37
0.711~5.93
0.604~3.92
0.568~2.35
0.555~4.27
0.463~2.88
0.953~7.15
1.03~3.06
0.658~10.4
0.528~5.98
0.442~3.32
0,594~11.5
0.4237.48
0.305~4.80
0.276~5.33
0.539~10.4
0.4463.99
0.307~18.3
0.187~9.49
0.262~21.4
0.137~13.0
1.19~5.71
0.684~9.95
0.7234.37
0.558~12.2
0.484~6.53
0.467~3.14
GB15193.3—2003
剂量1=1.00）
剂量2=3.16
剂量3=10.0
剂量4=31.6
可信限
4.53~9.31
3.06~24.5
2.67~15.8
2.83~26.5
2.25~18.7
1.91~12.4
1.76~13.5
1.47~9.10
3.01~22.6
3.27~9.68
2.08~32.7
1.67~18.9
1.40~10.5
1.88~36.3
1.34~23.6
0.966~15.2
0.871~16.8
1.70~33.0
1.41~12.6
0.970~58.0
0.592~30.0
0.830~67.8
0.433~41.0
2.16~31.5
2.29~13.8
1.76~38.6
1.53~20.7
1.48~9.94
GB15193.3—2003
组2组3
反应率
表A.2（续）
剂1=0.316
剂量2=1.00
剂量3=3.16
剂量4=10.0
可信限
0.434~7.28
0.356~4.12
0.793~7.10
0.333~16.9
0.303~5.87
0.244~23.1
0.172~10.3
0.148~12.1
附录B
（规范性附录）
反应率-概率单位表
反应率-概率单位表
剂册1=1.00%
剂量2=3.16
剂量3-10.0
剂量4-31.6人
可信限
1.37~23.0
1.13~13.0
2.51~22.4
1.05~53.4
0.958~18.6
0.771~73.0
0.545~32.6
0.467~38.1
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