【国家标准】 小鼠睾丸染色体畸变试验

ICS07.100
中华人民共和国国家标准
GB15193.8—2003
代替GB15193.8-1994
小鼠墨丸染色体畸变试验
Mice testicle cells chromosome aberration test2003-09-24发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-05-01实施
GB15193.8—2003
本标准全文强制。
本标准代替GB15193.8-1994《小鼠睾丸染色体畸变试验》。本标准与GB15193.8—1994相比主要修改如下：在“范国”中增加了受试物的具体内容：食品生产、加工、保藏、运输和销售过程所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及共成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等；并增加不适用范围；在“剂量分组”中：高剂量组的设计方法增加一条“急性萍性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出L.Ds。时，高剂量组则按以下顺序：a）10g/kg体重，b）人的可能摄人量的100倍；或e）一次最大灌胃剂量进行设计”，并增加阳性对照和阴性对照的设计方法；
在“操作步骤”中：将秋水仙素的给予时间从“处死前Sd\改为“处死前6h”；括号内\按0.1～0.2mL/10g体重给受试物”改为\注射体积：0.1mlL/10g体重~0.2ml/10g体重”。自本标准实施之日起，GB15193.8—1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：浙江医科大学、北京市卫生防疫站。本标准主要起草人：徐惟安、姚小曼、朱慧娟。本标准于1991年首次发布，本次为第一次修订。60
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小鼠睾丸染色体畸变试验
GB15193.8--2003
本标准规定了小鼠睾丸染色体畸变试验的基本技术要求。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程所涉及的可能对健康造成危害的化学，生物和物理因素对整体哺乳动物丸生殖细胞染色体的损伤，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。本标准不适用于有证据表明受试物或其代谢产物不能达到靶组织的情况。2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。2.1
睾丸染色体畸变chromosomeaberration intesticlecells辜丸染色体数目和结构异常，包括裂际、断片、易位、微小体、常染色体单价体、性染色体单价体。3原理
不同周期的雄性生殖细胞对化学物质的敏感性不同，多数情况下化学诱变剂诱发染色体畸变必须经过DNA复制期，故在前细线期处理。第12天～14天采样，以观察作用于前细线期引起的精母细胞染色体畸变效应。
4仪器与试剂
全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为蒸馏水。4.1实验室常用设备。
4.21%柠檬酸三钠（分析纯）：取1g柠檬酸三钠，加蒸馏水至100mL。4.360%冰乙酸（分析纯），取60mL冰乙酸，加蒸馅水至100mL。均宜新鲜配制。5实验动物
选用健康成年雄性小鼠，体重25g～30g，每组至少5只。动物购买后于试验前适应环境3天～5天。
6剂量及分组
受试物应设三个剂量组，最高剂最组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2LDso，低剂量组应不表现出毒性，分别取1/4LDsm和1/8LDso作为中，低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出LDs时，高剂量组则按以下顺序：a）10g/kg体重；b）人的可能摄人量的100倍；或c）次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。同时另设溶剂对照组和阳性对照组。每组至少5只存活动物。所选用的阳性物在体内应能引起精细胞染色体结构畸变。可采用不同于受试物的给子途径一次给61
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予阳性物。可采用丝裂霉素C(1.5mg/kg~2mg/kg，腹腔注射，-次）或环磷酰胺（40mg/kg，腹腔注射，每天一次，连续5天)。
阴性对照组应给予溶剂或介质，方式与受试物组相同。如果有资料表明所使用的溶剂或介质无致突变作用.可不做未处理对照，否则应另设未处理对照。7操作步骤
7.1受试物配制
一般用蒸馅水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素等配成乳浊液或悬浊液。受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊液等）保存具有稳定性。7.2实验动物的处理
灌胃给予受试物，每天一次，连续5天。各组均于第一次给予受试物后的第12天～14天将受试动物处死制片。动物处死前6h腹腔注射秋水仙素4mg/kg体重～6mg/kg体重（注射体积：0.1mL/10g体重～0.2mL/10g体重）。秋水仙素宜当天新鲜配制。用颈椎脱白法处死小鼠。7.3标本制备
7.3.1取材
取出两侧睾丸，去净脂肪，于低渗液中洗去毛和血污，放人盛有适鼠1%柠檬酸三钠或0.4%氯化钾溶液的小平血中。
7.3.2制片
7.3.2.1低渗：以眼科镊撕开被膜，轻轻地分离曲细精管，室温下低渗，低渗时间视具体条件而定。7.3.2.2固定：仔细吸尽低渗液，加阅定液（甲醇：冰乙酸=3：1)10mL固定。第一次不超过15min，倒掉固定液后，再加入新的固定液固定20min以上。7.3.2.3离心：吸尽固定液，加60%冰乙酸1mL~2ml，待大部分曲细精管软化完后，立即加人倍量的固定液，打匀、移人离心管，以1000r/min离心10min。7.3.2.4滴片：齐去大部分上清液，留下约0.5mL～1.0mL，充分打勾制成细胞混悬液，将细胞混悬液均匀地滴于冰水玻片上。每个样本制得2张～3张。空气干燥或微热烘下。7.3.2.5染色：用1：10Giemsa液（pH6.8）染色20min~40min。7.4阅片
7.4.1阅片要求
在低倍镜下按顺序寻找背景清晰、分散良好、染色体收缩适中的中期分裂相，然后在油镜下进行分析。
7.4.2观察项日：染色体的结构畸变中，除了可见到裂隙、断片、微小体外（按照GB15193.6执行）。此外，还要分析相互易位、X-Y和常染色体的单价体。互易位：相互易位涉及非同源染色体问末端断片的交换。它需要二次断裂和修复。有常染色体间的易位和染色体与常染色体间的易位。常染色体易位时能产生环状的多价体，或链状多价体。如一次易位可形成环状四价体、链状四价体、三价体加上一个单价体（cⅡ十I），若二次、三次或四次易位，则可观察到六价体、八价体或十价体。性染色体的易位，可以有X染色体或Y染色体与常染色体易位。花对照成年动物中自发易位率极低，低于0.01%。老年动物可稍有增加。X-Y和常染色体的单价体：亦称早熟分离。对照动物X-Y单价体较常见，约有0～10%。因X和Y染色体是长臂的远端，非同源的片段相接。X，Y的分离常可引起不育。常染色体的单价体是由于不联会（源片段间配对合子的缺失），或联会消失（由于交叉失败而分离）而造成，它们在对照组动物中较少见，因为交叉在双线期形成，正常配对的联合一直到中期I末。常发生于最小一对常染色体中。62
8数据处理
GB15193.8—2003
实验组与阴性对照组的断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别按Kastenbaum和Bowman所述方法进行统计处理，如P<0.05则可以认为有显著意义。63
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