【商检行业标准(SN)】 动物源性食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜残留量的检测 高效液相色谱-质谱/质谱法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2318—2009
动物源食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜残留量的检测高效液相色谱-质谱/质谱法
Determination of diclazuril,toltrazuril,toltrazuril sulfoxideand toltrazuril sulfone residues in foodstuffs of animal origin-HPLC-MS/MSmethod
2009-07-07发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-01-16实施
本标准的附录A、附录B和附录C均为资料性附录本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国河北出人境检验检疫局负责起草本标准主要起草人：王凤池、郭春海、艾连峰、陈瑞春、邢军本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准http：//foodmate.netSN/T2318—2009
1范围
动物源食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜残留量的检测高效液相色谱-质谱/质谱法
SN/T2318—2009
本标准规定了动物源食品中地克珠利、要曲珠利、妥曲珠利亚砜和要曲珠利砜残留量的高效液相色谱-质谱/质谱检测方法。
本标准适用于鸡肉、鸡肝、鸡肾、猪肉、猪肝、猪肾、免肉、免肝、兔肾和鸡蛋中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚和要曲珠利残留量的检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法提要
试样中的地克珠利、要曲珠利、要曲珠利亚磁和要曲珠利磁残留用乙酸乙酯提取，通过凝胶渗透色谱(GPC)净化后，用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS)测定，内标法定量。4试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙睛。
4.2乙酸。
4.3环已烷。
4.4乙酸乙酯。
4.5甲醇
4.6无水硫酸钠：分析纯，经650℃灼烧4h，置于干燥器内备用。4.7乙酸乙酯-环已烷（50十50）：相同体积的乙酸乙酯与环已烷互溶。4.8甲醇-水（80十20）：80体积的甲醇和20体积的水互溶4.9标准品：地克珠利（CAS号：101831-37-2）、妥曲珠利（CAS号：69004-03-1）、妥曲珠利亚砜（CAS号：69004-15-5）、要曲珠利（CAS号：69004-04-2）和氛代要曲珠利纯度均于等于98.0%。4.10地克珠利、要曲珠利、要曲珠利亚矾和要曲珠利矾标准储备液：分别称取每种标准品各10mg（准确至0.1mg），用甲醇溶解，并分别定容到50mL棕色容量瓶中，混匀，该溶液的浓度为200μg/mL，可在一18℃以下避光保存12个月，4.11地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜混合标准中间液：分别取标准储备液（4.10)各0.5mL~10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成混合标准中间液，浓度为10μg/mL，可在一18℃以下避光保存6个月。
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SN/T2318—2009
4.12地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚和妥曲珠利砜标准工作液：根据需要，吸取一定量的混合标准中间液（4.11）.用甲醇稀释至所需浓度，现用现配。4.13内标标准储备溶液：称取氛代妥曲珠利标准品10mg（准确至0.1mg），用甲醇溶解，并分别定容到50mL棕色容量瓶中，混匀，该溶液的浓度为200μg/mL，可在一18℃以下避光保存12个月。4.14内标标准工作液：量取标准储备液（4.13)0.5mL~10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成内标工作液，浓度为10μg/mL，可在一18℃以下避光保存6个月4.150.45um有机滤膜
5仪器和设备
5.1高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)。5.2凝胶渗透色谱仪：配有紫外检测器（固定波长：254nm）。5.3涡旋振荡器。
5.4旋转蒸发器。
5.5均质器。
5.6离心机.最大转速大于等于3000r/min6试样制备与保存
6.1动物肌肉、肝脏和肾脏样品
从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约0.5kg，用组织捣碎机充分捣碎均匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记，于一18℃以下冷冻避光保存。6.2禽蛋样品
从所取全部样品中取出约0.5kg，去壳，勾浆，均分成两份，分别装人洁净容器中，密封，并标明标记，于一18℃以下冷冻避光保存。7测定步骤
7.1提取
肌肉样品、禽蛋样品称取5g（精确至0.01g）.肾脏、肝脏样品称取2.5g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加人50uL内标工作液（4.14），涡旋混合30s后，加入25mL乙酸乙酯和5g无水硫酸钠，以10000r/min均质提取1min，3000r/min转速离心10min。然后禽蛋样品准确分取10mL提取液，肌肉，肾脏、肝脏样品分取5mL提液于15mL的玻璃管中，45℃下氮气吹干。用乙酸乙酯-环已烷（4.7)溶解残渣并定容至10mL.待GPC净化。7.2净化
7.2.1凝胶渗透色谱条件
a）净化柱：22gS-X3Bio-Beads填料，200mmX20mm（内径），或相当者；流动相：乙酸乙酯-环已烷（50+50.体积比），流速：5.0mL/min；b)
进样量：5mL；
d）净化程序：弃去7.5mL以前的洗脱液，收集7.5min～12.5min的洗脱液。7.2.2净化过程
按上述的条件进行GPC净化。净化后将收集的洗脱液蒸干，用1mL甲醇-水（4.8）溶解残渣，涡漩振荡，过0.45μm滤膜，供HPLC-MS/MS分析。7.3高效液相色谱-串联质谱测定7.3.1液相色谱条件
a）色谱柱：C18，150mmX2.1mm（内径）.5μm，或相当者；2
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流动相：0.1%乙酸水溶液-乙睛（45+55，体积比）；b)
流速：200μL/min；
色谱柱温度：30℃；
进样量：10μL。
质谱条件
离子化模式：电喷雾负离子扫描模式（ESI-)；b)
质谱扫描方式：多反应监测（MRM）：c）其他参考质谱条件参见附录A。7.3.3测定
7.3.3.1定量测定
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根据样液中被测物的含量情况，选定响应值相近的混合标准工作液。标准工作溶液和样液中分析物的响应值均应在仪器的检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参差进样测定。在上述仪器条件下，各分析物的参考保留时间为：妥曲珠利亚砜4.73min、妥曲珠利砜7.81min、地克珠利11.02min、氛代妥要曲珠利13.53min、妥曲珠利13.61min；标准品色谱图参见附录B。7.3.3.2定性测定
地克珠利和妥曲珠利亚有两组离子对，能够定性分析。在相同实验条件下，在扣除背景后的样品质量色谱图中，所选择的离子对均出现。经对比所选离子对的丰度比与标准品离子对的丰度比，其值在允差范围内（允差范围值参见表1），则可判断样品中存在对应的被测物。表1定性确证时相对离子丰度的最大允许误差相对离子丰度/%
允许的相对误差/%
7.4空白实验
>20~50
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。8结果计算和表述
试样中的残留含量，按式（1)计算：X-XAXeXA.XV
AsXciXA,Xm
式中：
试样中待测组分残留量，单位为微克每千克（ug/kg）；>10~20
标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；样品中被测组分峰面积；
混合标准工作溶液中被测组分的峰面积；样液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；标准工作溶液中内标物的峰面积；样液中内标物的峰面积；
样液最终定容体积，单位为毫升（mL）：样品的重量，单位为克（g）。
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（1）
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测定低限、回收率
9.1测定低限
本方法的测定低限：肾脏、肝脏为20μg/kg；肌肉为10μg/kg；禽蛋为1ug/kg。9.2回收率
地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜、妥曲珠利矾在不同基质，三个不同添加水平的回收率范围参见附录 C。
http：//foodmate.net参考质谱条件：
鞘气压力：30unit；
辅助气压力：8unit；
附录A
（资料性附录）
质谱条件1）
负离子模式电喷雾电压（IS）：—3500V；毛细管温度：320℃；
源内诱导解离电压：10V；
Q1，Q3分辨率：0.7；
碰撞气：高纯氩气；
碰撞气压力：1.5mTorr；
其他质谱参数见表A,1。
化合物
妥曲珠利亚
妥曲珠利碱
地克珠利
要曲珠利
氛代妥曲珠利硕
被测物的采集时间段、离子对和碰撞能量保留时间
离子对
440.1/371.1a
440.1/383.1
456.0/456.0a
404.1/334.0a
404.1/335.0
424.0/424.0
427.0/427.0
注：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异.测定前应将质谱参数优化到最佳。a为定量离子对。
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碰撞能量/eV
非商业性声明：附录A所列参考质谱条件是在ThermoTSQQuantumUltraAM型液质联用仪上完成的，此处多列出试验用仪器型号仅为提供参考.并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。5
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附录B
（资料性附录）
标准物质多反应监测质谱图
妥曲珠利亚爾
440.1/37L.1
妥曲珠利亚佩
440.1/383.1
要曲珠利風
456.0/456.0
要曲珠利
424.0/424.0
氛代妥曲珠利
427.0/427.0
地克珠利
404.1/334.0
地克珠利
404.1/335.0
图B.1地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利标准多反应监测质谱图http：//foodmate.neti/min
添加浓度/（ug/kg）
600(3000)
400(1000)a
500(3000)
250(1000)
500(3000)a
250(1000)a
括号中为地克珠利的添加水平。表C.1
（资料性附录）
回收率范围
添加回收率范围数据
回收率/%
妥曲珠利亚砜
78.9~91.3
80.5~93.5
82.5~95.5
86.4~99.6
81.0~94.1
86.1~99.7www.bzxz.net
84.3~98.0
ht
妥曲珠利砜
85.7~99.3
地克珠利
85.0~98.5
80.8~94.0
SN/T2318—2009
妥曲珠利
84.4~96.8
SN/T2318—2009
Foreword
AnnexA，AnnexBandAnnexCof thisstandard isinformativeThis standard wasproposed by and is under the charge of National Regulatory Commission for Certi-ficationandAccreditation
This standard was drafted byHebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureauof the People's Republic of China.
The main drafters of this standard are Wang Fengchi,Guo Chunhai,Ai Lianfeng,Chen Ruichun andXing Jun.
This standard is an Entry-Exit inspection and quarantine professional standard promulgated for thefirsttime.
bt
SN/T 2318—2009
Determinationofdiclazuril,toltrazuril,toltrazuril sulfoxideandtoltrazurilsulfoneresiduesinfoodstuffsofanimaloriginHPLC-MS/MSmethodSlope
The standard specifies the methods of determination of diclazuril,toltrazuril,toltrazuril sulfoxide andtoltrazuril sulfone residues in animal origin foods by liquid chromatography-mass spectrometry.This standard is applicableto thedetermination of diclazuril,toltrazuril,toltrazuril sulfoxide and tol-trazuril sulfoneresidues in poultry muscle,poultry liver poultrykidney,swine muscle,swine liverswine kidney.rabbit muscle, rabbit liver,rabbit kidney and egg.2References
The following normative documents contain provisions which,through references in this text,consti-tute provisions of this standard.For dated references,subsequent amendments to,or revisions of,any of these publications do not apply.However,parties to agreements based on this standard areencouraged to investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative docu-ments indicated below.:For undated references,the latest edition of the normative document re-ferredtoapplies.
GB/T6682Waterforanalytical laboratoryuseSpecificationandtestmethodsAbstractofthismethod
The residues in the test sample are extracted with ethyl acetate,cleaned up with gel permeationchromatography(GPC).Determination is madebyLC-MS/MSusing the internalstandardmethod.4Reagentsandmaterials
Unless specifically noted,all reagents used should be of HPLC grade;\water\is fhe first grade waterprescribedbyGB/T6682.
Acetonitrile.
Acetic acid.
Cyclohexane.
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SN/T2318—2009
Ethyl acetate.
Methanol.
Anhydrous sodium sulfate: Analytical grade,lgnite at 65o for 4 h,and keep in a tightly closedcontainerafter cool
Cyclohexane-ethyl acetate(50+50):Mix the same volume ethyl acetate and cyclohexane.Methanol-water(80+20):Mix80volumeunitsmethanoland20volumeunitswater.Standardsof diclazuril(CASNo:101831-37-2),toltrazuril(CASNo:69004-03-1),toltrazurilsul-4.9
foxide（CASNo:69004-15-5），toltrazuril sulfone（CASNo:69004-04-2）and toltrazuril-D3：purity≥98.0%
Stock standard solution:Accurately weigh 10 mg (accurate to 0.1mg) standard,dissolve in4.10
50 mLmethanol and mix to homogeneity.The concentration of the solutions is 200μg/mL.The solu-tionsshouldbestoredbelow-18℃ indarkformorethan12months4.11Mixed standard solution:Accurately measure0.5mL~10mL stock standard solution(4.10)respectively into a 10 mL umber volumetric flask,dilute withmethanol to 10 mL and mix to homoge-neity.The concentration of the solution is 10 μg/mL.The solutions should be stored at -18℃ indarkformorethan6months.
4.12Standard workingsolution:Accuratelymeasureanappropriatevolume of mixed standard solution(4.11),and diluteto suitable concentration withmethanol-water(80+20)just beforeuse.4.13S
Stock internal standard solution:Accurately weigh 10 mg (accurate to 0. 1mg) internal stand-ard,dissolve in 50 mL methanol and mix to homogeneity.The concentration of the solutions is200ug/mL.Thesolutionsshouldbestoredbelow-18Cindarkformorethan12months.4.14Internal standardworkingsolution:Accuratelymeasure0.5mL~10mLinternalstock stand-ard solution(4.13)respectively intoa10mLumber volumetric flask,dilute withmethanol to 10 mLand mix to homogeneity. The concentration of the solution is 10 μg/mL.The solutions should bestoredat-18℃indarkformorethan6months.4.15o.45μm filter.
Apparatusandequipment
Liquid chromatography-mass spectrograph,equipped with electrospray ion sourceGelpermeationchromatographywithUVdetector(fixedwavelength：254nm).
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