【国家标准(GB)】 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定 分光光度法

ICS 65. 120
中华人民共和国国家标准
GB/T23874—2009
饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法
Determination of xylanase activity in feed additives-Spectrophotometric method
2009-05-26发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-10-01实施
本标痛的附录A为资料性附录。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。GB/T 23874—2009
本标准山中国农业大学农业部饲料工业中心、武汉新华扬生物有限公司，广东溢多利牛物技术股份有限公司负责起草。
本标准主要起草人：陆文清、曹芸、刘兴海、詹志春、刘亚力、陈清华。L/wwwfoodmate.net
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饲料添加剂水聚糖酶活力的测定分光光度法
本标准规定了用分光光度法测定饲料添剂中木策糖酶的活力。本标摊适用于饲料添加剂木聚糖酶产品，最低检出量为10.0U/g：2规范性引用文件
GB/T 23874-2009
“下列文件中的条款通过本标的引用面成为本标谁的条款。丸是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注且期的引用文件，其最新版本适用于本标准。CB/T6682分析实验案用水规格和试验方法3原理
木聚糖酶能将木骤糖降解成享糖利单糖。还原性寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与 3,5-一硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖景成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中木聚糖酶的活力。
在 37 ℃,PH 为 5,50 的条件下,每分钟从浓度为 5 tr1g/tnL. 的木糖辫液中降解释放 1 μmol 还原赫所需要的酶量为一个酶活力单位汀4试剂与溶液
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的一级水。4. 1氢氧化钠溶液.浓度为 200 g/L称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100mL。4.2乙酸溶液,浓度为 0. 1 mol/L吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解,定容至100 L。4. 3 乙酸钠溶液,浓度为 0. 1 mm/L称取三水乙酸钠 1.36 g。加水溶解，定容至100 mL。4. 4乙酸-乙酸钠缓冲溶液,浓度为 0.1 mol/I,pH为 5. 50称取二水乙酸钠23.14g，加人冰乙酸1.70mL。再期水溶解，定容至2000m。测定溶液的pH。如果pII偏离5.50，再用乙酸溶液（4.2)或乙酸钠溶液（4.3）谢节至5.50。4. 5木糖溶液(C,H10g),浓度为 10. 0 mg/mL称取无水本糖1.000 ,tz酸-Zz酸钠缓冲溶液(4.4)溶解.定容至100 tmL4. 6水聚糖溶液浓度为 100 mg/mL称取木聚糖（SigmaX0627\)1.00g，加人0.32g氢氧化钠，再加人90mL水，磁力搅打，同时缓慢1）SigmaX0627是商品名，给出这一信息是为了方瘦本标准的使用者，并不表示对该产品的认而。如果其他产品能有相的效果，则可使用这些等效的产品。ht
GB/T 23874—2009
加热，直至本聚糖完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30min，加入0.5ml.冰乙酸，继续磁力搅拌，测定其pH。划果pH为5.50，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4)定容至100mL。如果pH偏离5.50，再用乙酸溶液（4.2)或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.50，然后再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4)定容至100mL：使用前适当摇勾。4避光保存，有效期为12h。4. 7 DNS 试剂
称取3,5-—硝基水杨酸3.15g，灿水500tnL，搅拌3sn~5s,水浴至45℃。然屑逐步加人100ml氢氧化钠溶液（4.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，落液温度不要超过48℃）。冉逐步加人四水酒石酸钾钠91.0多、米酚2.50g和无水亚硫酸钠2.5G多。继续45℃水浴加热，同时补血水300mL，不断搅拌，直到加入的物质究全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过憩器过滤。滤液，诺存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7后方可使用，有效期为180d。
5仪器与设备
5.1实验室用样品粉碎机或碾体。5.2分样筛：孔径为0.2511
5.3分析犬平感量0.001g
5. 4 pII计:精确至 0. 01。
5.5磁力搅拌器：附加热功能。
5.6电磁振荡器。
5.7烧结玻璃过滤器：孔径为0.45μm。5.8离心机：最大离心加速度不小于2000g。5.9恒温水浴锅：温度控制范围在30℃～60℃之间，精度为0.1℃。5.10
秒表：年小时误差不超过5s。
5.11可见分光光度计。
移液器:精度为 1 μL。
6绘制标准曲线
6.1吸取乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.4)4.0L，加人DNS试剂（4.7)5.0mL，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0 mL,制成标滩空白样。6. 2 分别吸取木糖溶液(4. 5)1. 00 mL,2. 00 mL,3. 00 mL,4. 00 nL,5, 00 ml.,6. 00 ml, 和 7. 00 mI.,分别用缓冲溶液（4.4）定容至100mL，配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/ml.、0.40mg/mL.0.50mg/ml.0.60mg/mL和0.70mg/mL木糖标准溶液。6.3分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL（做两个平行）分别加人到刻度试管中，再分加人2.0mL缓冲液(4.4)和5.0mLDNS试剂(4.7)。电磁振荡3s~~5s，沸水浴加热5min。然后用自米水冷却到室温，再用水定容至25ml.。以标准空白样为对照调零，作540nm处测定吸光度A值。
以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均带要重新绘制标准曲线。
7反应用酶液的制备
7.1固体样品的反应用酶液制备
按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.001g。加人40mL乙酸-乙酸钠缓溶液2
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（4.4）。微力搅拌30min，再用缓冲溶液（4.4)定容至100mL，在4℃条件下避光保存1h～2h。上离心机（5.8)1000g离心3min5min，取1清液，再用缓冲溶液（4.4)做适当稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶活力最好能控制在0.04U/mL~0.10U/mL之间）。7.2液体样品的反应用液制备
液体样品可以直接用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.1）进行稀释，定容（稀释后的酶液中本聚糖酶活力最好能控制在0.04U/mL~-0.10U/mL,之间）。如巢稀释后酶液的pII偏离5.50,需要用乙酸溶液（1.2)或乙酸钠溶液（1.3)调节校正至6.50，然后再用缓冲溶液（4.4)做适当稀释定容8测定步骤
吸取10.0mL木聚糖溶液（4.6)37℃平衡20tmim吸取10.0mL经过适当稀释的酶液（7.1或7.2),37℃平衡10min。吸取2.00mI.经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加人到刻度试管中，再加人5nLDNS试剂(1.7），电磁振荡3s55。然后加人2.0mL木聚糖溶液（4.6），37℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却率室温，加水定容至25mL，电磁振满3s~~5s。以标症空用样(6.1）为空白对照：在540nm处测定吸光度Az
吸取2.00ml.经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入刻刻度试管中，再加人2.0ml.木聚糖（4.6)（已经过37℃平衡），电磁振荡3s~5s37℃精确保温30in，加人5.0mLDNS试剂（4.7）电磁报菌3s~5s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用白来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡 3 s～5 。以标准空白样(6.1)为空白对照,在 540 nm 处测定吸光度 Ae。9试样酶活力的计算
用于酶解反应的稀释酶液中木聚糖酶的活力按式(1)和式(2)计算：X; - E(A -An)XK+Ca) ×1 000
武中：
Xn\-—稀释酶液中木聚糖酶的活力,/mL;A
酶反应液的吸光度；
Ar——酶空白样的吸光度；
K—标雅曲线的斜率；
标摊曲线的截距；
-木糖的摩尔质量,M(C,H.O,)=150.2g/nal;M
t-酶解反应时间，min;
1 000-- 转化因子,1 mmol = 1 000 μrnol。1
X，值应在0.04U/mI--0.10U/mL之间。如果不在这个范围内，应重新选择液的稀释度，再：进行分析测定。
X = X× D,
式中：
X--：试样中木聚瓣酶的活力,U/g(或 U/mL);D试样的稀释倍数。
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酶活方的计算值保留三位有效数字。10重复性
每个试样应取两份平行样进行分析测定，相对误差不超过8.0%，一者的平均值为最终的酶活力测定值，
附录A
（资料性附录）
样品酶活力与建议称样量的对应关系样品酶活力与建议称样最的对应关系见表A.1表A.1
木案糖酶活力/(U/g)(或者 U/mL)22 000
500~1 993
200~499
50~199
http:
GB/T23B74—-2009
称样量/g(或考 mL)
0. 1~0. 2
0. 5~1. 0
2. 0~5. 0
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打印日期：2009年10月14日
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饲料添加剂木糖酶活力的测定
分光光度法
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并不880×12301/16印张0.75字数9千字2009年8月第一版2009年8月第一次印刷*
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