【商检行业标准(SN)】 非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1559.1—2005
非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程Protocol of direct immunofluorescent assay for African swine fever2005-02-17发布
华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2005-07-01实施
SN/T 1559.1—2005
本标雅参腹了国际乱场工生组织（F)公有的诊断流验和疫用标范手所（204年版）关丁非渐猪瘟诊断中的免疫荧光抗体试方法。本标准的附录A为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并力口本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标雅主要起草人：刘中勇、许如苏、游洪、周军，本标摊系肯发布的出人境检验检疫行业标滩。1范围
非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程本标准规定了直接免疫荧光试验检测非洲猪瘟病毒的方法。本标准适压兰非洲猪瘟病毒的检测。2仪器设备
2.1冷冻动升机。
2.2杭温培养箱。
2.3 炭光斥微镜。
2.4冰箱。
2.5 leigion 管(160 mmx_6 mm)3试验材料
3.1非洲猪瘟标准毒株。
3.2非洲猪蓝荧抗体:使用前用稀释液稀释至T作浓度。3.3蒸馏水(pH 7.4),臣制方法参见陆录A，3.4 0.01mol/L pII7.4PBS(磷酸盐缓冲液),制法参贝附录 A，3.5缓冲计油：使用中性尤自发炭光的升油(分析纯)配制,配制方法参见附录 A。3.6丙谢：使用前置冰箱预冷。
SN/T 1559.1—2005
3. 7待检组织;尤菊采取可疑病猪的牌脏、扁桃怀,肾肝、淋匹结,置丁尽可能的低温、怎不能冻结的容器内运送,保存。
4操作方法
4.1待检组织制备
4.1.1组织切片、印片或涂片
将待检组织制成厚度为m~7m的冰冻片，也可制成印片或涂片4.1.2白细胞培养物涂片
4.1.2.1配制组织悬液
用红织研磨器或搞碎器将被检组织磨碎，加人0.01II01/LPH7.=PBS和抗菌素.配制成20%的组续悬液每毫组织悬液的抗菊素含量为：青需烹1000II,链看素1ng,庆大需素 50 IUJ,制需菌素50 IC),备用。
4. 1. 2.2制备白细胞
采取免康猪,用玻离珠脱或压肝素抗凝(每升猪止含肝素[0) TTI),7c0 g离心30 min,吸山血清或血浆备压：刃外吸取白纽胞.并用细胞基础培养液洗涤3次，备月，4.1.2.3配制细胞培养液
用1述心清或血裂近细胞基培养液亚制成细跑培养液，侦血滑或血浆的终浓度为兆～3们为。SN/T 1559.1—2005
4.1.2.4培养白细胞
将亢组胞态浮于细胞培养液宜，使细胞含量为10/rL，分装于=6c nm1×16 mm 的leig1on管巾何管 1. 5 rmL.将试管与水平而成 5~-1c°倾斜放置、置于 5为二氧化碱坏境巾,37℃培养 2 d~-4 d,4.1.2.5接种
何份组织悬液接种 3管白细咆培养物，勾管接种 0.2 rmL，置十 5%C0坏境中,37℃培养2 h-~ d.
收管白细孢磨养物接猎洲猪痘标萃株作阳性对照：另取「门细胞培养物不接种病毒作明性对照。4. 1. 2. 6涂片
用已接种待检组织凹细胞培养物涂片，制成待检标本，而阳性对照管的细胞培养物涂片，制殷阳性刘照标本，用明性对照管的细胞培养物涂片,制战阴性对照标木，4.2固定
分别将述标本在空温下自然风干，用预冷为酮周定10min。4.3漂洗
将上述标本分别而 0.0l mol/L.pII 7.4PB5漂洗 3次，每次 5 min,最后用蒸馅水漂洗 3 mir。4.4加荧光抗体
在标木加上作浓度的非洲猎遍荧光抗体，然后将标本放人湿您内，置丁37恒温培养箱内湿4.5漂洗
重复4.3，自然风干。
4.6镜检
下标本二加1滴缓冲油，置荧光显微镜下检查。5结果判定
防性对照的细胞方荧光产牛，阳性对照的纸胞出现荧光，则对照成立，可进行果判定待检标本的细胞出现荧光的判定阳性：得检标本的细胞无荧光出现的，判定阴叫。2
A.1pII7.4蒸馏水
附录A
（资料性附录）
试剂配制
用盘酸或氢氧化钠调蒸瘤水的pH值至7.。A. 2 0. C1 mol/L. pH 7. 4 PBS(磷酸缓冲盐溶液)磷酸二氢铂(KI,PO)
磷酸氢(NIIPO,[2H,O)
氯化钠(NaCI)
加蒸馏水至
缓冲甘油
0. 01 mol/L pII 7. 2 PBS
T a00 ml.
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SN/T 1559. 1-2005
中华人天共和函人境盗验检疫
行业标滩
非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程SV/T 1559.1 2005
中国标准出版社出版发行
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