【商检行业标准(SN)】 食源性致病菌基因芯片鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1543—2005
食源性致病菌基因芯片鉴定方法GeneChip methods for identification of foodborne pathogens2005-02-17发布
华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2005-07-01实施
本标雅的附录A和阴录为规范性附录。言
本标雅出国家认证认可监督管理委员会提出并H口。SN/T 1543—2005
本标准起草单位：中华人民！和国「海出人境检验检疫局、户华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。
本标淮主要起草人：顾鸡、西际婿、黄就华、韩伟。本标系首次发布的山人境检验检疫行业标雅，范围
食源性致病菌基因芯片鉴定方法本标舰定了食源性致病菌基因芯片检测方法，本标准适压一食源性致病菌的定性检测和整定，2规范性引用文件
SN/T1543—2005
列文件中的条款通过本孙准的号用而战为尽标谁的亲，凡是群H期的与用文件·其随后所有的修改单（不包括勘误的内穿）或修订版均不适用于本标准.然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文伴的最新版本，凡是不注谢的引用文件·其最新版今适用于本标准GE/T682分析实验室用水规格和谢验方法SN/T 1193基因检测实验室技术要求3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用一本标准：3. 1. 1
食源性致病菌foodbornepathogens来源于食品和农流产品，可造成人体健康抢害的一类细菌，3. 1. 2
聚合酶链反应polymerase chain reaction聚金酶链反应;简称PCR，共原理是使用一杀熊寡核苷酸作为反应的引物，一祭与物的序研与待测核苷酸（为模板)中某特定位点具有五补作用，而本身之间不发兰万补作用。在镁离子、四种单核苷较（dNTP）模板LNA及引物的条件下,PCR反应在 LNA聚个酶伴化卜,通过温度的摄间变化使LNA发生变性、退火及延偏反应从而个贼两个亏补位点之训的LNA片段，这样的反应反复逃衔，侵第一个坏产牛的LNA片段得以扩增：经25个～30个循环，扩增倍数达10，3. 1. 3
引物pinter
成用化学方法合成对与知待扩增基因开段二侧INA列互补的宴核营酸，作为PCR扩增的起始物。
基因探针gene probe
在苯因芯片检测或其他基因杂交检测巾，成用化学方法合成山知特异性TNA序列的寡该苗酸片段，关H用标记物浅行标记的·类衰核苷酸产品，3.2缩略语
下列缩略语适用于本标准。
PCRpolyintr&se chain Ieaction 简称 PCR.Genechipgene chip基因芯片。
DNAdenxyribonueleic acid脱氧核核酸，SN/T 1543—2035
dNTPdeoxyrihanurlenside:1riphasphalc脱氧核！酸一磷酸。dATPdeoxyacetosint Ltiplosphale鼠氧三磷酸。dCTP
deoxyrydine triphosphale脱氢胞苷三磷酸：dGTPdeoxygianusine(riphusphale脱氧鸟苷三体骏dTTpdeoxythymidinetripaosptate脱氧胸升磷酸。duTpdeoxyuridinetriphosphate脱氧尿节三磷酸。bpbase pair碱基对.
设备和材料
4.1微生物实验宰通月坡璃器血、移液管、培养血等4.2忆温培养箱：30·60℃。
台武小型离心杭：
4. 4移液枪:0, 5 μL~-1 C00 μL.4.5
水平式电泳仪，
4.6 PCR扩增仪。
4.7凝驳电泳紫外检测仪。
4.8 pH计.
4.9非荧光基因芯片担描仪。
恒溫水浴锅。
PCR操作柜。
继水器，双蒸水器。
4.13杂交箱。
4. 14芯片点样仪，
5试剂和材料
除另有规定外，试剂为分祈继，实验用水为火菌去离子水和瞪继水5. 1 基因芯片检测所用引物序列5.1.1真纸菌、霍舌驱菌，弯由菌属，小肠结肠炎耶冬森氏菌检测用引物（对）序列为：16 S,5 BIOTIN GGAGCATGTGGTTTAATTCG 3:16-A:E-1IOIIN-CGACACGAGCIGACGACA-35.1.2F, 0157:H7、副落血性菌检测用可[物(对)序列为：23-S:5'-BIOTIN-GAAAGGCGAAAAGAACC-3'23 A:5'EICTIN ACAAAAGGTACGCAGTCAC3'5.1.3福氏志贺氏菌、单增李斯特菌、金黄色翁萄球菌恰测用引物(对)序列为：16 A,E' BIOTIN GCTGCCTCCGTAG 3SHI-:E:-BIOIIN-TAATACATGCAAGTCGA-35.1.4沙门氏菌属、肠炭沙门氏菌检测用引物(对)序列为S:1 : 5-BIOTIN-GCCAACCATTGCTAAATTGGCGCA-3S.5:5 BIOTIN GGTAGAAATTCCCAGCGGGTACTGG 3SE16 :E'-1IOIIN-AGGTTCAGGCAGCGGTTACT-3*SEI8:E-BIOTIN-GGGACATTTAGCGTTITTG-5.1.5苯因芯片检测所用引物扩增的产物长度基因恶片检测PCR扩增产物长度见表 1.2
阳性参照（红肃共同探）
亚性对照(军圳菌深针)
空白刘照水)
空H对照2(小点样)
金黄色萄萄球茵
单增李斯等菌
到溶征性弧
沙门氏茵质
肠奖沙门医室
弯曲菌屎
E. c01: 0.5?. I17
小肠结肠炎那尔森氏第
氏是氏菌
5.2基因芯片检测所用探针序列
表 1PCR扩增产物长度
护增产物长度
SN/T 1543—2005
约128<954：081)
无扩增产物
元扩增产物
无扩增产物
314(24~-337)
311(1~-312)
128(937-1064)
103(458-~550)
381（湛序得到）
298（双序得到）
131(900--1 030)
103(269--571)
133(917-1 041)
309(19--65)
乱弧菌:5*-NH2-(T)12-CTCCAGCGTCTCCGCTAGATTC-3弯由菊马:5*-NI2-(I)12-TCTAGCAAGCTAGCACCGICATATC-3*耶尔森IE菌:5*-NH2-(T)I2-CTAAAGCATCTCTGCTAAATTCCGTGG-3E.GOI1 0IE7 H7:5-NH2-CT)I2-GCAGTCACCCCATAAAAGAGGCT-3?副溶而性弧菌:5:-NII2-(T)12-GGTACGCAGTCACAGGACAAAGCC-3福L志贺低菌:E'-NH2-(T)I2-GCGAAACAGCAAGCTGCTTCC-3单增李新特菌:5’ NI2（T)12 CGATAGCCGAAACAATATTACAAAAGCGTGG 3′金蒙色薇球：5\-NH2-(T)12-CGACAAGAGCGTATTACACIITTGAACCATCCGG-3*沙门丢菌属 -NI2-(T)[2-GCTTCTCATCGACAACCTAACTTCTGCGCC-3*肠我沙L菌 : 5-NH2-(T)I2-TTTTCCGTGGGCGTATTCA-3直细菊 :5*-NH2-[)I2-GGAIGTCAAGAGIAGGTAAGGT'[GTTCGCG-3性对照(年团菌)5*-NII2-{T)12-ATAGCATTGGTGCCGATTTGGGGAAGA-35.3主要试剂
除另有舰定外,所有最剂均为分析绝或牛化试产5. 3. 1 基内组 DA提取试剂盒。5.3.2溶菌素、溶葡萄球菌素。
5.3.3PCR扩增试剂盒。
5.3.4基固芯片杂交试剂盒和甚因芯片显色试剂盒。5.3.5琼胎糖：电泳纯
5.3.6溴化乙锭。
5.3.7DNA分了量标记：50bp~300bp8TAF电冰缓冲液[储备液（X.50)]：5. 3. 8
称取 60,5 g Tris 碱,14.725 rIL 冰乙骏、25 mL 0, 5 mol/I EDTA(pI 8. 0):川蒸馏水定穿250.混勾，空温保存，使用所，用蒸馏水做5门倍帮释即刻。3
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5.3.9样缓洲液：0.25%滤晰蓝，40%蔗视。5.4食源性致病菌基因芯片
5.4. 1基片的质量控制(见附录 A)5.4.2点样
根据芯片设计阵列·采用机械芯片点样仪或手工点样装置，将各个核菩酸探针分布在其特定位置区域。
5.4、3阳性对照、阴性对照、空自对照的设置所性对照：为纽菌其右的基因片断·十要从细菌二6S和23S RN1获得防性对照：以结核杠菌DNA为模板。空白对照：设两个，一是点样时以水做空白对点到共片上；一是不做点样的空白对照。5.4.4基因芯片检测位点探针的设置探针点样位点地友2，随着检测纽菌种类的加，点样图可以树成的亨鼓，点样位置安排作点样图设计的参考指导，根据实际的需要，点样位置可以做延当调整。表2探针点样示意图
拨针检测列
严性攀照
阴性对照
空对照
金黄色萄萄球菌
单李斯特茵
藓乱弧菌
到溶血萄
沙门氏菌属
岳炎沙门氏菌
弯曲南属
结肠夸由菊
人肠杆菌心157
耶尔森乓菌
程民贺民菌
基因芯片的质量控制
中专办中
中中心
中专办中
e争季学6
专办#办心
定位标志列
无满点，位点规则，人小均孕一致，点与点的距离为300&r-～50CuⅢ，无其基探针的污柒，各位点标摊品质控试验杂交的信号为背景信号的以上。注：径号值为256缀灵度值，
设置定位标志点列，每定位标志点方，平行位臂设置探针检测行，定位标志点与最近的深针检测点距离是2倍点间距.每行探针重复点样6次-点刚距300 1rm～5c0 um。设置叫性对照、阴性对照、空白对照。
6检测方法
6.1方法提要
本方法是在常规食源性致病菌标准检测方法苯础「,在细菌苯因水平［，对些食源性致病菌进行SN/T1543—2005
鉴定和进一步确认的技不方法。首先，在常规培养法检测发现的可性菌落进行牛化鉴定的同时，妆同样的菌落提取LNA模板进行PCR铲增，球脂裤凝胶电泳观察PCR扩增产物；应月固定有食源性常致病菌特异探针的基内恶片再对PCR护增产物进行杂交反应，法行鉴定利确证，对食源性致病菌常规检测结果判断作避一步佐证,起到平行鉴定的作月。6.2检验步骤
因芯片检测食源性致病菌的步骤剂1。祥品
常规培养法/标准法检测
可疑菌落或落养物
DNA模板提取
特异性PC:1R增
特异性苯因芯片整定
结果分新，报告
图1食源性致病菌基因芯片检测步骤6.2.1细菌DNA的提取（可参照相关试剂盒操作说明）电泳
在 20cμL缓冲液中加人纯培养 24 h 的菌落豌肉烫1.5 mL混匀后：加50uL溶菌酶（10 mg/mL）和或ul.溶带菊球素（.mg/m7作用2h后：比400u消化缓液混勾,身尔uI.蛋白降K，置58℃保温30mim再加入260l无水婷混勾，将样品移至1NA提取用微型栏中，8C00r/tmin离心1 min,丢弃度液;加 500μL洗涤液.温下10 000 r/anir离心30 s;重复定步：云除残留洗涤液后,将微型杜胃放洁净的1. 5 rm1.离心管中，在柱体央加入0 μ1.解离液(6e℃预热）,窄湿作月2 rmin后,在室流,10 000 I/rrir:离心 1 rnin,获得 LNA样品可置4℃或一20℃保存。6.2.2PCR扩增（可参照相关试剂盒操作说明）打开PCR仪电源，预热20min，按照以卡要求配制50μl.PCR反应体系：10×huffr:r,5μl.,VPs(5！mol/μl)5 μ1,MgCl25l,引物对(10 pmol/1)各 2μl,Tag NA聚合悔(5U/μl)a.5 μl,模板XA（3.-1.0ug)1OuL、双蒸水22.5T.PCR反应条件：94℃预变性2mit。进入据坏.94℃变SN/T 1543—2035
性2；6%退火2℃s:72℃延仲20s,共个循环。72°℃延件rmin，4%.保存。设两管空白对照：为提取DNA时设置个提取空广对照(以水代替样品)，二是PCR反应时的空对照(以水代替T)NA模板）.
6.2.3PCR扩增产物电泳检测
称取C.75g琼脂(生化级)济：50ml，1×TAE电泳液中，配制浓度为1.5%琼脂糖凝胶：H牛加人溴已锭的比例为:琼脂糖与溴亡锭体积比为109 ml：5 {I.配制。将制成的琼脂糖凝骏板放人电泳槽内，人1×TAE电泳液使液而刚刚没过凝胶。取10LPCR护增产物与6XLoadingBuffer加样缓冲液3μL混合均勺，点样到琼胎糖凝胶」:,进行电泳分相,每个PCR拉增产物设一个空白对照,并用ladeicr DVA Markcr 做分了量标记，以估让特征条惯凸现的位置。凸泳条件电压_1c V；时间和 min。紫外检测仪下观察电泳结果并记录，6. 2. 4 特异性基因芯片鉴定
按椎美食源性致病菌基因芯所操作说明进行具体步骤见附录A。7结果计算与判断(见录 B)
7.1基因芯片鉴定结果:经基匹芯片扫捕仪判册或H他方式判断,在芯片特异性[区域出现明显的杂交显色皮。
7.2FCR拉增产物电泳结：有单清晰的增条芸,电泳对照成立7.3结果判断：几部，基因心片鉴定结果仅作为常规食源性致病菌检验鉴定结果的佐证8废弃物处理和防止污染的措施
按SV/T1193的规定我行。
待测基片：每批检三片：
附录A
（规范性附录）
基因芯片生产用基片质控方法
检测用探针：5\hiotin-ATGCATGCATGCATGCATGC-NH.3'探钉，5OD;h)
点样仪:GSM417:
牛物芯片识读仪；
品色试剂盒（含：洗液2、洗液3、抗体液、显色液）；e
）2点样缓冲液，
A.2检验方法
A.2.1 点片
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取100pmol/的检用探针2L，加28μ水，35L点样缓冲液，泥匀。用点样仪以“线性模，两排，何排5点\点样，点样后室温激置 12 h。贴杂交舱备用A.2.2显色
在杂交舱中加人 200 μl.洗液2,率温放置2 min;吸除液2,向杂交舱中加人2C0 μL.抗体液,牵湿放置 20mitl,吸除抗体液：间舱中训入 200 ul.洗液2,室温静置 5 rmin,意复次;向芸交舱中川人200μL洗液3。打于显色盒，将10℃显色液均勾覆盖在显色载玻片的色显色区内。吸除苯因芯片杂交舱中的洗液3，在杂交舱中加人200L鼎色液，12℃恒流避光改置15min。A.2.3检测
为去杂交舱,将基片显色区小心用水冲洗一下,置 12℃烘十,然后游基片面朝下拟作 Bai0 BE2. 0生物芯片识读仪的片上检测，其体操作见仪器使用说明，检测图像经ArrayDoctor2.软分析白动输出检测结果。
A,2.4判定
每张基片的2个点的平均信号度不得低于50，否则不合格三张片都介格，则批个格：
一张片中有张甚片不台格，但信号强度不小下39,则批合格：否则，批不合格。SN/T 1543—2035
试剂和仪器
B.1.1 PCR苯因动增仪
附录Ｈ
（规范性附录）
食源性致病菌基因芯片检测程序B.1.2特制食源性致病菌基因芯片或类似产品，Baio芯片杂交家剂盒或类似产品B. 1. 3
H.1.4Bain 芯片辰色试剂盒或类似产品：.1.5非荧光基因志片扫仪或类似产品。B.2
操作步骤bZxz.net
杂交过程
将PCR扩增产物放骨在PCR扩增仪上，圳热至8，变性，rin后还速放：C的冰块中：a)
保接5mir.
吸 1μ.PCR增产物与2μ.杂交缓凌混：h）
在基内与反应区中加人200μL须杂交液，在42℃条件下静置5rmin.然吸除预杂交液。c
b)湿合液全部加人到基因芯片反应区内。d)
恶基因感片激入预热至尔交温度的杂交箱或恒温箱内，进行20 min杂交反应友应后，去除基因芯片友应以中的溶液，在基丙心片反应区中加人20GaL预热至类交温度的洗液1，在架交温度下保湿5mineg
h）云除基匹芯片反应区中的济液,重复\)步骤两次。i）在因芯片反应区中川入 200 μl.洗液 2,窄温放2 min啵除基闪恶片反应区中液体。
向基因芯斤反成区中加人抗体液，室温下效置2mit:。1
去除基因心片友应区中溶液，
向基因芯片反应区中加人200 uL就液2,室温放置5 r-重复洗一次。去除基因芯片反应区中溶液;向反应舱加人260 μL洗液 3,室温下效置 2 mi:n）
太除反应×中溶液，加入200μL显色液，室流下放置.0min，o）
去除反应区中溶被，用纯净水冲洗芯片显色区。p)
将苯因芯片烘十放于检测仪上检测,脑收集数据杂交结果的检测
将杂交后的芯放二基内芯片扫捕仪或类似产肺上，打万分析软件，点击扫捕图像，按照软B.2.2.13
件界而向导，点击预览，碟定探针的位置、然后点士扫插、即可得扫插后的瘀交结果：得习描图像后再进行扫描果分析，百先确定扫描点剂人小,然后输人扫猎图像的行、列，重复点的数靠，调整好每个扫播点的位置，是每个点在其对应框的中心，再确定好导点框位置后，点击分析按钮，就可以得到分析后的完整讨捕结更。
个有效的杂交结果要符合两点要求；空凹点的信号平均值.即背景平均值要小于二0a
质控点倍号的平均值要产于背景平均值10倍以：有这群，才被认为结果有效，8
B.2.2.3特异性杂交的信号除了符合上面的两点之外，还要符合两点：）所性点的信号乎均值要高于肯景平均伯「0倍以「。SN/T 1543—2005
b）阳性点与质控点的平均值比值要在0,4以「满足了以「四点套供的结果才被汰为是阳性的杂交后号：
B.2.2.4相反非特只性的信号的判定标摊为：a）阳性点与质控点的平均筐比值要小于0.35。b）非特异性点的信号平均值要小于8倍的背景均信号估。这样的信号的期被认为是非特异性的交产生的信弓。
B.3结果判定与表述
B.3. 1基因芯片系统监控
H.3.1.1附性对照点的信号估应大于5倍所性对照点的平均信号伯：B.3.1,2阴性对照点的信号值应低于二/15阻件对照点的平均信号值.信号值最高不高于60。B.3.1.3空白点的信号值应低于1/15阳性对照点的平均信号值，最产不高于30,B. 3.2判断方法
B.3.2.1菌培养液成分个成产生任何1扰信号：阳性对照、阴性对照及半自对照点的信号值符台上述要求、
B.3.2.2性养结果：暨个检测休系正常时，探针检测点的信号值应人于15倍阴性对照的平均后号值，非特异杂交点的信号值应小丁三分之一阳性对照点的平均信值。B.3.2.3混介污架的培养菌落：整个检测休系正常时,2行以上的深饣检测点的信号值均应大丁15倍阴性对照的均信号值。
B.3.3结果计算
基因愁片定性判断结果算以式(B,1)表云：R
武中：
R——检测信号比值比：
....(1
A一一待检菌的信号比值，别待检菌位置的信号的平为值/叫1性对照位置的信号的平均值B阴性对照的信号比值，即阴性对照位置的信号的平均值/阳性对照位置的信号的平均值，R小于3 为阴性,3-~1为可疑-大于4为阳性。B.3.4结果表述
基因芯H鉴签定结果必须结合相关标准方法的检测结果，一并考虑，当R直小于3对，结果为未检出。当R值人丁 1寸，综果为检出;当R值在3～二范围时,结集为可疑,以相关标推方法的检测结果为雄：
注：PCR 检测下限为 20 cfu1/ml.。基因患片检下限为 620 ci1/ml.。SN/T 1543-2005
中华人天共和函人境检验检疫
行业标滩
食源性致病菌基因芯片鉴定方法SN/T 1513 2003
中国标准出版社出版发行
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电话：6852392658517548
中国系程出版社秦皇岛印刷厂印刷#本 880×1230 1/16
印张字数_9 字
2003年5月第一次印别
2005 年 3 月第一版
书0：155066·2--6179定价10.C0元出本社发行中心调换
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